C57-ras轉(zhuǎn)基因小鼠模型雜交1代CB6F1的生長(zhǎng)發(fā)育特性

劉甦蘇，吳 曦，周舒雅，王辰飛，彭澤旭，左 琴，李保文，賀爭(zhēng)鳴，范昌發(fā)

（中國(guó)食品藥品檢定研究院，國(guó)家嚙齒類實(shí)驗(yàn)動(dòng)物種子中心，北京 100050）

C57-ras轉(zhuǎn)基因小鼠模型雜交1代CB6F1的生長(zhǎng)發(fā)育特性

劉甦蘇，吳 曦，周舒雅，王辰飛，彭澤旭，左 琴，李保文，賀爭(zhēng)鳴，范昌發(fā)

（中國(guó)食品藥品檢定研究院，國(guó)家嚙齒類實(shí)驗(yàn)動(dòng)物種子中心，北京 100050）

目的測(cè)定自主建立的轉(zhuǎn)基因致癌性模型C57-ras小鼠與BALB/c小鼠雜交1代的生長(zhǎng)發(fā)育特性參數(shù)，為該模型的商業(yè)化供應(yīng)提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。方法 將雄性轉(zhuǎn)基因陽性C57-ras小鼠與野生型雌性BALB/c小鼠交配，獲得雜交1代（CB6F1 c-Ha-ras+/-）并測(cè)定平均產(chǎn)仔數(shù)、離乳率、陽性鼠生長(zhǎng)發(fā)育情況、轉(zhuǎn)基因陽性率等參數(shù)。結(jié)果 在生長(zhǎng)發(fā)育方面，雌鼠平均每窩產(chǎn)子數(shù)為8只，離乳率為90％，雄雌性別比符合預(yù)期。CB6F1的平均出生重為（1.73±0.05）g，10周齡時(shí)陽性鼠平均體重雌性（24.38±1.74）g，雄性（29.42±1.72）g。雄性鼠體重明顯高于雌性，差異存在極顯著性（P＜0.01）；基因型檢測(cè)陽性率為46.9％，符合遺傳規(guī)律。結(jié)論 轉(zhuǎn)基因致癌性模型C57-ras小鼠與BALB/c小鼠雜交1代的生長(zhǎng)發(fā)育特性正常，可實(shí)現(xiàn)規(guī)模化商業(yè)供應(yīng)。

C57-ras轉(zhuǎn)基因小鼠；人原癌基因c-Ha-ras；CB6F1；生長(zhǎng)發(fā)育特性；

小鼠的生長(zhǎng)發(fā)育特性是其生理學(xué)數(shù)據(jù)的組成部分也是動(dòng)物飼養(yǎng)管理和健康狀況的重要指標(biāo)，對(duì)建立該品系的商業(yè)化供應(yīng)體系具有指導(dǎo)意義［1］，尤其對(duì)于新建立的轉(zhuǎn)基因品系而言，是該品系不可或缺的背景數(shù)據(jù)。

C57-ras轉(zhuǎn)基因致癌性小鼠模型是通過原核注射方法，將人原癌基因c-Ha-ras導(dǎo)入C57BL/6小鼠基因組中自主建立［2，3］，旨在建立新一代基因修飾動(dòng)物模型以用于我國(guó)臨床前藥物致癌性實(shí)驗(yàn)，促進(jìn)我國(guó)建立符合 ICH規(guī)范的新評(píng)價(jià)替代方法體系［4-5］。由于C57-ras轉(zhuǎn)基因小鼠純合致死［6］，以轉(zhuǎn)基因雜合子（c-Ha-ras+/-）與C57BL/6野生型小鼠交配的方式進(jìn)行傳代繁殖。通過觀察，發(fā)現(xiàn)C57-ras轉(zhuǎn)基因小鼠繁殖能力及仔鼠成活率低，而之前文獻(xiàn)報(bào)道其自發(fā)腫瘤的發(fā)生率較高［5，7］，故此類臨床前致癌性安全評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)所用動(dòng)物為C57-ras陽性小鼠和BALB/cJ的雜交1代陽性鼠（CB6F1 c-Haras+/-），以降低背景腫瘤對(duì)實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)確性的影響［7］。目前，我們已經(jīng)完成部分該模型的陽性致癌物驗(yàn)證工作［10］，也開始向部分臨床前藥物評(píng)價(jià)中心提供。而該模型的平均產(chǎn)仔數(shù)、離乳率、生產(chǎn)曲線等基本參數(shù)尚未測(cè)定，給建立商業(yè)化供應(yīng)體系帶來一定難度。本文在測(cè)定c-Ha-ras轉(zhuǎn)基因陽性小鼠在CB6F1背景上生長(zhǎng)發(fā)育性能參數(shù)的同時(shí)計(jì)算該基因檢測(cè)陽性率，旨在為其生產(chǎn)供應(yīng)及應(yīng)用于藥物安全評(píng)價(jià)提供參考。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及實(shí)驗(yàn)環(huán)境

9～10周齡的雄性轉(zhuǎn)基因陽性C57-ras小鼠42只及8周齡野生型BALB/cJ雌鼠45只均飼養(yǎng)于國(guó)家嚙齒類實(shí)驗(yàn)動(dòng)物種子中心［SCXK（京）2009-0017］，屏障環(huán)境，溫度（18～26）℃，相對(duì)濕度50％～70％，自動(dòng)光控（12 h明/12 h暗）。飼料購自北京維通利華，經(jīng)60Co輻照滅菌。飲用水為經(jīng)高壓滅菌的自來水。

本實(shí)驗(yàn)在中國(guó)食品藥品檢定研究院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)監(jiān)督下進(jìn)行。實(shí)驗(yàn)人員均持有北京市實(shí)驗(yàn)動(dòng)物從業(yè)人員上崗證。實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)符合“3R”原則，動(dòng)物飼養(yǎng)管理及實(shí)驗(yàn)操作符合《北京市實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理?xiàng)l例》法規(guī)的要求，實(shí)驗(yàn)結(jié)束后實(shí)驗(yàn)動(dòng)物處死方法為安樂死。

1.2 儀器及試劑

TaqDNA聚合酶、DNA marker、dNTP、PCR緩沖液、蛋白酶K均購置于由寶生物工程大連有限公司（TaKaRa）。1.5 mL離心管和PCR管及蓋購自于Axygen。美國(guó) Sartorius公司 BSA220ZS型電子天平、Thermo Nanodrop 2 000微量紫外分光光度計(jì)。引物由諾賽基因研究公司合成。

1.3 動(dòng)物交配方式

雄性轉(zhuǎn)基因陽性 C57-ras小鼠與雌性野生型BALB/cJ小鼠1：1交配獲得F1代，交配采用隔天交配并記錄陰道栓的方式，每天17點(diǎn)合籠（標(biāo)記為0 d），次日（標(biāo)記為0+1 d）上午9點(diǎn)開始檢查雌鼠陰道栓，未成功檢栓的雌鼠與雄鼠0+1 d的17點(diǎn)合籠，成功檢栓的雌鼠2只一籠飼養(yǎng)待產(chǎn)，雄鼠則于0 +2 d下午17點(diǎn)合籠，以此類推。并于見栓14 d后挑選待產(chǎn)雌鼠，確認(rèn)懷孕率。共進(jìn)行3次繁殖交配實(shí)驗(yàn)，每次實(shí)驗(yàn)選用的繁殖親本為前一次未成功交配的雌雄鼠。

1.4 生長(zhǎng)發(fā)育測(cè)定指標(biāo)

分別記錄交配雌鼠的陰道栓見栓率以及后期懷孕率、雌鼠產(chǎn)仔數(shù)，小仔的性別比及離乳數(shù)。隨機(jī)選取4窩仔鼠，分別稱量其初生、7 d、14 d和21 d時(shí)窩重并計(jì)算單只仔鼠重量；小鼠離乳后經(jīng)PCR方法檢測(cè) CB6F1基因型，分別稱量雌雄各 20只CB6F1（c-Ha-ras+/-）轉(zhuǎn)基因陽性鼠在4、5、6、7、8、9和10周齡時(shí)體重。

1.5 PCR反應(yīng)擴(kuò)增檢測(cè)雜合CB6F1小鼠基因型

檢測(cè)194只離乳小鼠，剪尾后進(jìn)行蛋白酶K消化并提取基因組DNA。每只小鼠取100 ng基因組DNA，PCR檢測(cè)基因型，引物設(shè)計(jì)針對(duì)轉(zhuǎn)基因的編碼序列，上游引物為 Pri.PFT，下游引物為 Pri.PRN1735（序列見表1），目的片段408 bp。PCR條件為：95℃ 5 min變性；95℃ 30 s；62℃ 30 s，72℃30 s，30個(gè)循環(huán)。采用內(nèi)參基因Gapdh復(fù)檢陰性樣本，確認(rèn)樣本DNA提取正常，上下游引物序列及Tm值見表1。產(chǎn)物取5 μL用1.5％ 瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

表1 PCR反應(yīng)引物序列及退火溫度Tab.1 The primer sequences and annealing temperature of PCR reaction

表2 野生型BALB/cJ雌鼠見栓率、雌鼠受孕率及檢栓成功率Tab.2 The rate of vaginal plug，pregnancy rate and success rate of vaginal plug check in the wild-type BALB/cJ female mice

表3 雌鼠窩產(chǎn)子數(shù)，仔鼠的性別比及離乳數(shù)Tab.3 The number of newborn mice，weaned mice and sex ratio of the newborn mice

1.6 數(shù)據(jù)處理

用Excel統(tǒng)計(jì)實(shí)驗(yàn)所得數(shù)據(jù)，CB6F1（c-Haras+/-）轉(zhuǎn)基因鼠生長(zhǎng)體重?cái)?shù)據(jù)進(jìn)行ANOVA檢驗(yàn)，性別比及轉(zhuǎn)基因陽性率進(jìn)行卡方檢驗(yàn)，P值小于0.05作為具有顯著性差異，P值小于0.01作為極顯著性差異。統(tǒng)計(jì)結(jié)果以±s表示。

2 結(jié)果

2.1 野生型BALB/cJ雌鼠見栓率、受孕率及檢栓成功率

一共進(jìn)行了3次平行的繁殖交配實(shí)驗(yàn)，交配雌鼠見栓率、雌鼠受孕率及檢栓成功率見（表2）。3次實(shí)驗(yàn)雌鼠見栓率及懷孕率差別比較明顯，1和2次實(shí)驗(yàn)結(jié)果較為接近，見栓率及懷孕率在20％和14％左右，第3次為89.3％和60.1％。三次實(shí)驗(yàn)的檢栓成功率相差不大，均值為61.6％。

2.2 BALB/cJ雌鼠窩產(chǎn)子數(shù)，仔鼠的性別比及離乳數(shù)

BALB/cJ雌鼠窩產(chǎn)子數(shù)，雜合CB6F1仔鼠的性別比及離乳數(shù)見（表3）。三批次平均窩產(chǎn)子數(shù)及離乳率的差異不明顯，平均窩產(chǎn)子數(shù)為8只，離乳率為90％。仔鼠性別比為1.2∶1與理論值1∶1進(jìn)行卡方檢驗(yàn)（P＞0.05），性別比符合預(yù)期。

2.3 CB6F1仔鼠的哺乳期窩重及單只仔鼠重

隨機(jī)抽取4窩哺乳期仔鼠分別測(cè)定初生0 d、7 d、14 d和21 d時(shí)的總重量并進(jìn)一步計(jì)算每窩的單只仔鼠重量（表4），發(fā)現(xiàn)初生0 d、7 d、14 d時(shí)單只仔鼠重量與雌鼠哺乳期的喂養(yǎng)仔鼠個(gè)數(shù)不存在相關(guān)作用，但21 d時(shí)第2窩單只仔鼠重量明顯高于其他窩的仔鼠重量。通過計(jì)算單只仔鼠平均出生重為（1.73±0.05）g，21 d離乳時(shí)平均出生重量為（11.36±2.26）g。

表5 雜合CB6F1小鼠基因型檢測(cè)陽性率Tab.5 Transgenic positive rate in the CB6F1（c-Ha-ras+/-）mice

2.4 生長(zhǎng)鼠的生長(zhǎng)發(fā)育情況測(cè)定

小鼠離乳后，隨機(jī)挑選基因型檢測(cè)為陽性的轉(zhuǎn)基因CB6F1（c-Ha-ras+/-）生長(zhǎng)鼠雌雄各10只測(cè)定其生長(zhǎng)體重情況（圖1）。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果看，生長(zhǎng)鼠雄性體重明顯高于雌性，差異存在極顯著性（P＜0.01）。

圖1 4周齡后CB6F1生長(zhǎng)鼠生長(zhǎng)發(fā)育情況Note.Abscissa is the age in weeks of mice，ordinate is the body weight of mice.Difference in the growth curves of male and female mice is analyzed using ANOVA method，＊＊P＜0.01 shows an extremely significant difference.Fig.1 The body weight of 4-week old CB6F1 mice

2.5 基因型檢測(cè)陽性率

通過檢測(cè)194只離乳小鼠，91只擴(kuò)增出目的條帶且重復(fù)實(shí)驗(yàn)后結(jié)果一致，判定為轉(zhuǎn)基因陽性；剩余103只陰性樣本PCR反應(yīng)均擴(kuò)增出內(nèi)參基因，部分實(shí)驗(yàn)結(jié)果見（圖2）。該批實(shí)驗(yàn)轉(zhuǎn)基因型檢測(cè)陽性率為46.9％與理論值50％進(jìn)行卡方檢驗(yàn)（P＞0.05），符合預(yù)期（表5）。

3 討論

近幾年來，采用為期6個(gè)月的基于轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型的致癌性評(píng)價(jià)替代實(shí)驗(yàn)在國(guó)內(nèi)部分臨床前藥物安全評(píng)價(jià)中心逐步開展起來，以逐步建立符合ICH S1B的評(píng)價(jià)體系［8］。為適應(yīng)此需求，周舒雅等從正常人血液中克隆得到的6.5 kb的c-Ha-ras基因并添加啟動(dòng)子和polyA后通過原核注射方法自主構(gòu)建轉(zhuǎn)基因小鼠模型C57-ras［3］。繼獲得此模型后，開展了部分生物學(xué)特性分析，明確了各臟器中轉(zhuǎn)基因表達(dá)譜［9］。同時(shí)聯(lián)合國(guó)內(nèi)的藥物臨床前安全評(píng)價(jià)機(jī)構(gòu)開展了致癌性評(píng)價(jià)研究［10］，有望獲得可用于藥物致癌性安全評(píng)價(jià)的快速、穩(wěn)定、有效的動(dòng)物模型。

在藥物臨床前安全性評(píng)價(jià)中，為降低自發(fā)腫瘤發(fā)生率，需采用C57-ras和BALB/cJ的F1代雜交陽性動(dòng)物，而該動(dòng)物的出生率、離乳率等參數(shù)尚未測(cè)定。此次實(shí)驗(yàn)中3次實(shí)驗(yàn)的受孕率及見栓率均低于文獻(xiàn)報(bào)道的BALB/cJ小鼠［11］，表明在繁育時(shí)小鼠性周期的鑒定是確保小鼠按計(jì)劃時(shí)間受孕的關(guān)鍵。對(duì)比3次實(shí)驗(yàn)結(jié)果，第1、2次受孕率及見栓率明顯低于第3次，可能與所用C57-ras公鼠（c-Haras+/-）有關(guān)，其均為首次交配，而第3次實(shí)驗(yàn)則為二次交配，表明今后實(shí)驗(yàn)時(shí)應(yīng)盡量選擇交配后的雄鼠用于提高受孕率及見栓率。通過3次實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)野生型BALB/cJ雌鼠平均產(chǎn)仔數(shù)及離乳率與文獻(xiàn)報(bào)道一致［12］，這表明CB6F1小鼠生長(zhǎng)發(fā)育正常。

圖2 PCR檢測(cè)CB6F1小鼠c-Ha-ras基因及內(nèi)參基因GAPDH表達(dá)Fig.2 Identification of c-Ha-ras and internal GAPDH gene expression determined by PCR in the CB6F1 mice

通過測(cè)定CB6F1窩重，發(fā)現(xiàn)哺乳期內(nèi)單只仔鼠的體重與雌鼠代乳的仔鼠的數(shù)量關(guān)系不明顯，平均初生體重為1.73±0.05g，14 d到21 d生長(zhǎng)速度最快，離乳時(shí)體重達(dá)到（11.36±2.26）g。分析4周齡后CB6F1陽性鼠的生長(zhǎng)發(fā)育情況（圖1），3-5周生長(zhǎng)較快，10周左右生長(zhǎng)進(jìn)入平臺(tái)期，且雌性小鼠較雄性小鼠生長(zhǎng)緩慢，二者體重差異存在極顯著性（P＜0.01）。由于目前暫無該陽性小鼠的相關(guān)文獻(xiàn)數(shù)據(jù)，參考C57BL/6與BALB/c小鼠數(shù)據(jù)后［12］，發(fā)現(xiàn)CB6F1背景的轉(zhuǎn)基因陽性小鼠（c-Ha-ras+/-）的體重介于二者之間。進(jìn)一步與相關(guān)文獻(xiàn)［12-14］實(shí)驗(yàn)結(jié)果比較，小鼠生長(zhǎng)發(fā)育性能正常，有利于該模型將來在臨床前安全評(píng)價(jià)中的應(yīng)用。

通過離乳小鼠基因分型檢測(cè)，統(tǒng)計(jì)出該基因檢測(cè)陽性率為46.9％，符合經(jīng)典遺傳學(xué)中的孟德爾定律。

本文測(cè)定了繁殖CB6F1（c-Ha-ras+/-）小鼠的母鼠平均產(chǎn)仔數(shù)、離乳率、陽性生長(zhǎng)鼠生長(zhǎng)體重，轉(zhuǎn)基因陽性率等參數(shù)，對(duì)于建立該癌癥動(dòng)物模型的商業(yè)化供應(yīng)體系，推動(dòng)我國(guó)基于轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型致癌性替代方法的建立有積極意義。

［1］田小蕓，惲?xí)r鋒，郭聯(lián)慶，等.Nrf2基因敲除小鼠的繁育及生長(zhǎng)發(fā)育的生物學(xué)特性［J］.中國(guó)比較醫(yī)學(xué)雜志，2009，19（2）：50-52.

［2］范昌發(fā)，岳秉飛，王軍志，等.含有人源原癌基因c-Ha-ras的轉(zhuǎn)基因小鼠的制作方法及其用途［P］.ZL 2008 1 0101666.0，2013.9.4.

［3］周舒雅，左琴，劉甦蘇，等.C57-ras轉(zhuǎn)基因小鼠模型的建立［J］.藥物分析雜志，2013，33（11）：1928-1934.

［4］范昌發(fā)，李波，王軍志，等.遺傳修飾致癌性動(dòng)物模型與藥物臨床前安全性評(píng)價(jià)［D］.北方實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科技年會(huì)，2009，66-68.

［5］Nielsen LL，Gurnani M，Tyler RD.Evaluation of the wap-ras transgenic mouse as a model system for testing anticancer drugs［J］.Cancer Res，1992，52：733-3738.

［6］Saitoh A，Kimura M，Takahashi R，et al.Most tumors in transgenic mice with human c-Ha-ras gene contained somatically activated transgenes［J］.Oncogene，1990，5（8）：1195 -1197.

［7］Urano1 K，Tamaoki N，Nomura T.Establishing a laboratory animal model from a transgenic animal：RasH2 mice as a model for carcinogenicity studies in regulatory science［J］.Vet Pathol，2012，49（1）：16-23.

［8］ICH Sl B.International conference on harmonization ICH S1B.（1997）［M/OL］.Guidance for industry S1B testing for carcinogenicity of pharmaceuticals.http:///www.fda.gov/cder/guidance/index.htm.

［9］劉甦蘇，周舒雅，高正琴，等.c-Ha-ras在轉(zhuǎn)基因小鼠模型C57-ras各組織中的表達(dá)譜分析［J］.生物技術(shù)通訊，2013，24（5）：636-640.

［10］呂建軍，劉甦蘇，左琴，等.C57-ras轉(zhuǎn)基因小鼠模型的MNU驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)［J］.藥物分析雜志，2013，33（11）：1935 -1940.

［11］張儉，黃星群，劉建軍.BALB/c小鼠繁殖性能的觀察及分析［J］.四川動(dòng)物，2006，25（1）：179-181.

［12］席曉霞，秦天達(dá)，吳潤(rùn)，等.SPF級(jí)BALB/c C57BL/6小鼠繁殖性能及生長(zhǎng)發(fā)育的比較研究［J］.畜牧獸醫(yī)雜志，2009，28（6）：11-12.

［13］吳清洪，顧為望，張嘉寧，等.SPF級(jí)C57BLP6J小鼠生長(zhǎng)發(fā)育和繁殖性能指標(biāo)的測(cè)定［J］.中國(guó)比較醫(yī)學(xué)雜志，2006，16（10）：606-607.

［14］張洪，鮑波.淺談國(guó)內(nèi)BALB/c小鼠及KM小鼠的基本生物學(xué)特性［J］.中國(guó)實(shí)用醫(yī)藥，2010，5（3）：252-254.

Characterization of growth performance of F1 hybrid CB6F1 C57-ras transgenic mouse model

LIU Su-su，WU Xi，ZHOU Shu-ya，WANG Chen-fei，PENG Ze-xu，ZUO Qin，
LI Bao-wen，HE Zheng-ming，F(xiàn)AN Chang-fa（National Rodent Laboratory Animal Center，National Institute of Food and Drug Control，Beijing 100050，China）

Objective To obtain the basic growth parameters of a self-established F1 hybrid CB6F1 C57-ras transgenic mouse model，and to provide basic information for commercialization of this mouse model.Methods F1 hybrid mice（CB6F1）were produced by crossing C57-ras heterozygous transgenic（c-Ha-ras+/-）male mice and wild-type BALB/cJ female mice.The average litter size，weaning rate，sex ratio，growth performance and C57-ras transgenic positive rate were recorded and analyzed.Results The average litter size was eight，weaning rate was 90％，and sex ratio was approximately in accordance with prediction.The average body weight of newborn mice was 1.73±0.05 g.The average body weight of 10-week old c-Ha-ras transgenic female and male mice in CB6F1 background was 24.38±1.74 g and 29.42 ±1.72g，respectively，which had a significant difference（P＜0.01）.The c-Ha-ras transgenic positive rate was 46.9％.which was in accordance with genetic rules.Conclusions The F1 hybrid mice（CB6F1）produced by crossing C57-ras heterozygous transgenic（c-Ha-ras+/-）male mice and wild-type BALB/cJ female mice show normal growth performance and development characteristics，and it can be used for large-scale commercial supply.

C57-ras transgenic mice，Human c-Ha-ras gene，CB6F1，Growth performance

R33

A

1671-7856（2015）04-0018-05

10.3969.j.issn.1671.7856.2015.004.004

中國(guó)食品藥品檢定研究院中青年發(fā)展研究基金（批準(zhǔn)號(hào)：2010C4）資助的課題。

劉甦蘇（1981-），女，助理研究員，主要從事模式動(dòng)物相關(guān)工作。

范昌發(fā)（1970-），男，博士，研究員，主要從事模式動(dòng)物研究。Email：fancf@nifdc.org.cn。

2015-01-21