小鼠腦脊髓炎病毒RT-PCR方法的建立及初步應用

李曉波,付 瑞,王 吉,衛 禮,王淑菁,岳秉飛,賀爭鳴

（中國食品藥品檢定研究院實驗動物資源研究所，北京 100050）

小鼠腦脊髓炎病毒RT-PCR方法的建立及初步應用

李曉波,付 瑞,王 吉,衛 禮,王淑菁,岳秉飛,賀爭鳴

（中國食品藥品檢定研究院實驗動物資源研究所，北京 100050）

目的 建立小鼠腦脊髓炎病毒RT-PCR方法并對方法進行初步應用。方法 根據NCBI發表的TMEV GD VII株（GI：62039）基因組序列設計特異引物，建立RT-PCR方法，驗證方法的敏感性和特異性；腦腔接種方式感染9只BALB/c小鼠，感染后第6天采集動物的腦、心、肝、脾、肺、腎、盲腸內容物和血清等樣本，用建立的方法進行檢測；同時檢測100份小鼠盲腸內容物樣本，對方法進行初步應用。結果 以GD VIIRNA為模板，建立的RT-PCR方法能夠擴增出約371bp的單一目的條帶，敏感性驗證顯示能夠檢測到的最低GD VII cDNA量為0.69pg/μL；以腦心肌炎病毒、淋巴細胞脈絡叢腦膜炎病毒、日本乙型腦炎病毒、小鼠諾如病毒及正常小鼠腦組織為對照進行方法特異性驗證，均未出現目的條帶。腦腔接種感染小鼠，所有小鼠在接種第3天均產生不同程度的精神萎靡后肢麻痹等癥狀，其中2只小鼠于第5天死亡；采集心、肝、脾、肺、腎、腦、盲腸內容物及血清等樣本進行檢測，所有小鼠的腦組織均檢測到GD VIIRNA，而其他組織均未檢測到；對100份小鼠盲腸內容物進行檢測，結果均為陰性。結論 建立的TMEV GDVII株RT-PCR方法能夠高效的檢測小鼠組織中的病毒感染，可作為實驗動物國家標準的有力補充。

Theiler氏腦脊髓炎病毒；GDVII；腦腔接種；逆轉錄-聚合酶鏈式反應

小鼠腦脊髓炎病毒（mouse encephalomyelitis virus，MEV）又稱 Theiler氏小鼠腦脊髓炎病毒（theilerˊsmouse encephalomyelitis virus，TMEV），分類上屬于小RNA病毒科，腸道病毒屬，主要侵害小鼠中樞神經系統，多數呈隱性感染，有時表現腦脊髓炎和后肢麻痹等癥狀［1-3]。目前已從世界各地分離到多個毒株，根據其毒力的不同分為兩個亞群：高毒力亞群以GDVII和FA株為代表，可引起急性致命性腦炎；低毒力亞群引起持續的中樞神經系統感染和炎性脫髓鞘［2，4]。實驗動物國標將TMEV列為SPF小鼠檢測項目之一。

本實驗建立了TMEV的RT-PCR檢測方法，通過對病毒感染動物組織樣本的檢測以及小鼠自然感染情況的監測，對方法進行了初步應用，試驗結果表明該方法可以作為動物中TMEV檢測的常規方法，是對實驗動物國標檢測技術的有力補充。

1 材料和方法

1.1 試劑

逆轉錄試劑為Sigma產品；PCR相關試劑購自Takara公司；RNA提取試劑盒為 QIAGEN產品；Trizol試劑為invitrogen公司產品；氯仿、異丙醇等其他化學試劑為北京化工。

1.2 病毒毒株

TMEV GDVII株購自ATCC，小鼠腦心肌炎病毒（mouse encephalomyocarditis virus，EMCV）、淋巴細胞脈絡叢腦膜炎病毒（lymphocytic choriomeningitis virus，LCM）、乙型腦炎病毒（Japanese B encephalitis virus，JEV）及鼠諾如病毒（murine norovirus，MNV）均為本室保存。

1.3 BALB/c小鼠

SPF級，3周齡，雌性，共10只，來自本院動物供應室【SCXK（京）2014-0013】，使用許可證號【SYXK（京）2011-0008】。

1.4 動物樣本

100份小鼠盲腸內容物樣品來自2014年10月北京市實驗動物會檢各實驗動物生產單位。

1.5 方法

1.5.1 引物的設計

根據NCBI發表的TMEV GDVII株（GI：62039）基因組序列，選取保守區域設計引物（表1）。

表1 GD VIIRT-PCR引物Tab.1 Primers for the GD VIIRT-PCR

1.5.2 病毒RNA的提?。篢MEV GDVII株BHK21細胞培養物經三次凍融后，分別取200μL按試劑盒的操作說明提取RNA，其他對照病毒也按照該方法進行。

1.5.3 RT-PCR方法的建立及反應條件優化：首先逆轉錄提取的TMEV RNA，再進行PCR擴增，對PCR反應體系dNTP濃度、DNA聚合酶量、引物濃度及退火溫度等進行優化，確定最佳反應條件。

1.5.4 敏感性測定：紫外分光光度法測定TMEV cDNA模板濃度，然后進行10-1～10-10系列稀釋，用建立的PCR方法進行擴增，檢測方法的靈敏度。

1.5.5 特異性測定：分別以 TEMV，EMCV，LCM，JEV，MNV及正常小鼠腦組織所提取的RNA為模板，用建立的RT-PCR方法進行擴增，驗證方法的特異性。

1.5.6 初步應用

1.5.6.1 感染試驗：10只BALB/c小鼠，9只腦腔注射30μL TMEV病毒液，另外1只作為PBS對照，逐日觀察，于感染后第6天對所有動物施行安樂死，取心、肝、脾、肺、腎、腦、盲腸內容物和血清等樣本，心、肝、脾、肺、腎、腦等組織用 Trizol試劑法提取RNA，盲腸內容物和血清參照1.5.2用RNA試劑盒提取RNA，隨后用建立的RT-PCR方法進行擴增。

1.5.6.2 樣本篩查：100份小鼠盲腸內容物，取100 mg加入900μL滅菌PBS，漩渦震蕩后10000 r/min離心 5 min，取 200μL上清按試劑盒說明提取RNA，隨后用建立的RT-PCR方法進行擴增。

2 結果

2.1 RT-PCR反應體系及條件

25μL逆轉錄體系包括5×RT buffer 5μL，dNTP 4μL，隨機引物1μL，逆轉錄酶和RNA酶抑制劑各0.5μL，RNA模板8μL，無RNA酶水6μL；逆轉錄反應條件為37℃ 90 min，72℃ 15 min，4℃ 5 min各1個循環。優化后的PCR反應體系為10× PCR buffer 2.5μL，dNTP 2μL，上下游引物各1μL，DNA模板2μL，HSTaq酶0.5μL，最后加滅菌雙蒸水補至25μL。反應條件為94℃ 30 s，56℃ 30 s，72℃ 1 min，共40個循環，最后72℃延伸7 min。

2.2 PCR產物測序

提取TMEV GDⅦ株細胞培養物RNA，用建立的雙重PCR方法進行擴增，產物送上海生工進行測序，序列經NCBIBlast比對，符合率均為99％。

2.3 敏感性測定

紫外分光法測得TMEV cDNA模板濃度為690 ng/μL，由圖1可見，建立的TMEV RT-PCR方法所能檢測的最大稀釋度為10-6，即該方法所能檢測的最低cDNA濃度為0.69 pg/μL。

圖1 TMEV RT-PCR方法敏感性Note：M：100 bp marker；1 to10：10-1 to 10-10 dilution of TMEV cDNA.Fig.1 Sensitivity of TMEV RT-PCR

2.4 特異性測定

用建立的 RT-PCR方法分別擴增 TEMV，EMCV，LCM，JEV，MNV及正常小鼠腦組織，結果以TMEV為模板產生371 bp的特異條帶，以其他對照病毒及正常小鼠腦組織為模板均不產生特異條帶（圖2）。

圖2 TMEV RT-PCR方法特異性Note：M：100 bp marker；1 to 7：TMEV，EMCV，LCM，JEV，MNV，normalmouse brain tissue，sterile ddH2O.Fig.2 Specificity of TMEV RT-PCR

2.5 初步應用

2.5.1 感染實驗

感染小鼠于感染第3天產生不同程度的臨床癥狀，比較對照小鼠表現為明顯發育不良，后肢麻痹、精神萎靡（圖3），其中2只小鼠于感染后第5天死亡。對感染小鼠心、肝、脾、肺、腎、腦、盲腸內容物及血清等組織樣本進行RT-PCR檢測，結果顯示，所有小鼠腦組織均產生371bp的目的條帶，其他組織均未出現目的條帶（部分結果見圖4）。對腦組織PCR產物測序，結果經NCBI比對，與TMEV（GI：62039）的符合率為100％。

2.5.2 樣本篩查：對會檢的100份小鼠盲腸內容物進行TMEV RT-PCR擴增，結果均為陰性。

3 討論

腦脊髓炎病毒在動物中的感染時有報道，不僅能夠感染小鼠，也可以感染大鼠，且感染率較高［5-10]。實驗動物國標中TMEV的檢測方法主要為血清學方法，本實驗建立了TMEV的RT-PCR方法，與以往報道的分子生物學方法相比［11]，不需要進行后續的探針檢測，用時短，且敏感性更高，特異性更好。

報道［12]，本實驗在腦腔注射感染小鼠的過程中采用眼角斜上方淺進針（2 mm）的方式進行注射，減少了對動物腦部的損傷。實驗用的TMEV毒株為強毒株GDVII，感染動物在第3天均出現明顯的臨床癥狀，變現為后肢癱瘓、震顫等，其中2只于感染第5天死亡。用建立的RT-PCR方法對感染小鼠的組織進行檢測，所有感染動物的腦組織均檢測到GDVII核酸，在肺組織產生約400 bp的非特異條帶，經測序排除了TMEV，其他組織均未檢測到，這與之前的報道結果一致［13-14]，可能病毒未通過血腦屏障，因而未感染到其他器官。

圖3 感染小鼠后肢癱瘓

圖4 感染小鼠組織RT-PCR擴增結果Note：M：100 bp marker；1 to 8：Heart，liver，spleen，lung，kidney，brain，serum，cecal contents；9：Positive control；10：Sterile ddH2O.Fig.4 The results of RT-PCR for tissues of infected mice

對100份小鼠的盲腸內容物樣本進行TMEV的篩查，結果均為陰性，初步表明近年北京地區實驗動物中TMEV的控制情況良好。

綜上所述，我們建立的TMEV RT-PCR方法具有良好的敏感性和特異性，可以作為實驗動物國標的補充檢測方法。

參考文獻：

［1] 田克恭.實驗動物病毒性疾?。跰].農業出版社，1992：99-104.

［2] Downs WG.Mouse encephalomyelitis virus.In：Foster HL，Small JD，Fox JG ed.Themouse in biomedical research，vol.II［M].New York：Academic Press，1982.341-352.

［3] Lipton HL，Rozhon EJ.The Theiler’smurine encephalomyelitis viruses.In：Bhatt PN，Jacoby RO，Morse HC，et al.Viral and mycoplasmal infections of laboratory rodents： effects on biomedical research［M].London：Academic Press Inc，1986.253-275.

［4] Lipton HL.Theiler’s virus infection in mice：an unusual biphasic disease process leading to demyelination［J].Infect.Immun，1975，11：1147-1155.

［5] Roble GS，Gillespie V，Lipman NS.Infectious disease survey of Musmusculus from pet stores in New York City［J].Journal of the Amecican Association for Laboratory Animal Science，2012，51：37-41.

［6] Hansen AK，Thomsen P，Jensen HS.A serological indication of the existence of a guineapig poliovirus［J].Laboratory Animals，1997，31：212-218.

［7] Hayashimoto N，Morita H，Ishida T，et al.Microbiological survey ofmice（Musmusculus）purchased from commercial pet shops in Kanagawa and Tokyo， Japan［J]. Experimental Animals，2014，Advance Publication：1-15.

［8] Lipton HL，Kim BS，Yahikozawa H，et al.Serological evidence that Mus musculus is the natural host of Theilerˊs murine encephalomyelitis virus［J].Virus Research，2001，76：79-87.

［9] Rodrigues DM，Martins SS，Gilioli R，et al.Theilerˊs murine encephalomyelitis virus in nonbarrier rat colonies［J].Comparative Medicine，2005，55（5）：459-464.

［10] Dammann P， Hilken G， Hueber B， et al. Infectious microorganisms in mice（Mus musculus） purchased from commercial pet shops in Germany［J].Laboratory Animals，2011，45：271-275.

［11] Zoll J，Galama J，Melchers W.Molecular identification of cardioviruses by enzymatic amplification［J].Molecular and Cellular Probes，1993，7：447-452.

［12] 李慧，王春華，羅姍，等.關于小鼠腦內不同注射手法的探討［J].實驗動物科學，2013，30（2）：48-50.

［13] Trottier M，Schlitt BP， Lipton HL.Enhanced detection of Theiler’s virus RNA copy equivalents in the mouse central nervous system by real-time RT-PCR［J].Journal of Virological Methods，2002，103：89-99.

［14] Shaw-Jackson C，Michiel T.Absence of internal ribosome entry site-mediated tissue specificity in the translation of a bicistronic transgene［J].JVirol，1999，73（4）：2729–2738.

Development and application of RT-PCR for detection of TMEV

LIXiao-bo，FU Rui，WANG Ji，WEILi，WANG Shu-jing，YUE Bing-fei，HE Zheng-ming
（Laboratory Animal Institute，National Institutes for Food and Drug Control，Beijing 100050，China）

Objective To develop RT-PCR for detection of TMEV and apply the method.M ethods To design specific primers on the basis ofGD VII（GI：62039）genome sequences published in NCBIand establish RT-PCR.To verify the sensitivity and specificity ofmethod after optimizing PCR.We infected 9 BALB/c mice intracerebrally and collected brain，heart，liver，spleen，lung，kidnet，cecal contents and serum samples the 6thday postinfection.The samples were tested by the TMEV RT-PCR.100 mouse cecal contents samples were also detected to apply the established method.Results The 371bp single band was amplified using GDVIIas template.Sensitivity test showed that the RT-PCR method can detect as low as 0.69 pg/μLGDVII cDNA.There were no objective band amplified when encephalomyocarditis virus，lymphocytic choriomeningitis virus，Japanese B encephalitis virus，murine norovirus and normalmouse brain tissue were used as case-control.All infectedmice showed symptom of different degrees such as depression and hind limb paralysis the 3th day postinoculation and two of infected mice died the 5th day postinoculation.Tissues such as heart，liver，spleen，lung，kidney，brain，cecal contents and serum were collected and tested for TMEV.All the brain samples were detected positive for GDVIIand other tissues were all negative；The 100 cecal contents samples were tested and all were negative.Conclusions RT-PCR for TMEV GDVIIstrain can detect virus infection inmouse tissues efficiently and can be used as a powerful supplement for the national standard of lab animal.

TMEV；GDVII；Intracerebral inoculation；RT-PCR

R-332

A

1671-7856（2015﹞10-0017-04

10.3969.j.issn.1671.7856.2015.010.004

國家科技支撐計劃“實驗動物質量監測體系的完善與檢測關鍵技術研究”（2013BAK11B00）。

李曉波（1980-），助理研究員，研究方向：實驗動物病毒學.E-mail：lxb8493059@163.com。

賀爭鳴（1957-），研究員，研究方向：實驗動物微生物學。E-mail：zhengminghe57@163.com。

﹞2015-08-31

研究報告