社區(qū)獲得性肺炎中肺炎克雷伯菌耐藥性及產(chǎn)AmpC酶基因菌株的檢測*

魏娟娟， 史曉艷

(1.榆林市中醫(yī)院 檢驗科， 陜西 榆林 719000； 2.榆林市星元醫(yī)院 檢驗科， 陜西 榆林 719000)

社區(qū)獲得性肺炎中肺炎克雷伯菌耐藥性及產(chǎn)AmpC酶基因菌株的檢測*

魏娟娟1*， 史曉艷2

(1.榆林市中醫(yī)院 檢驗科， 陜西 榆林 719000； 2.榆林市星元醫(yī)院 檢驗科， 陜西 榆林 719000)

目的： 探討社區(qū)獲得性肺炎(CAP)患者肺炎克雷伯菌耐藥性及產(chǎn)β-內(nèi)酰胺(AmpC)酶情況。方法： CAP患者72例，吸取痰液進(jìn)行肺炎克雷伯菌培養(yǎng)篩選分離，采用K-B法檢測肺炎克雷伯菌對8種抗菌藥物的耐藥性，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)( PCR)檢測肺炎克雷伯菌中AmpC酶基因的表達(dá)。結(jié)果： 72例患者共檢出100株細(xì)菌，肺炎克雷伯菌30株(30%)；肺炎克雷伯菌對亞胺培南無耐藥性，對頭孢吡肟、阿米卡星的耐藥率較低，而對青霉素類和第2、3代頭孢類藥物耐藥率較高；在30株肺炎克雷伯菌中，檢出AmpC陽性表達(dá)菌株11株(36.7%)。結(jié)論： 肺炎克雷伯菌對青霉素類和第2、3代頭孢類藥物耐藥，產(chǎn)AmpC酶基因檢出率較高。

社區(qū)獲得性肺炎； 克雷伯菌，肺炎； β-內(nèi)酰胺酶類； 耐藥性

社區(qū)獲得性肺炎(community acquired pneumonia, CAP)是指在醫(yī)院外、社區(qū)中罹患的感染性肺實質(zhì)炎癥[1]。由于臨床抗菌藥物的廣泛應(yīng)用，細(xì)菌的耐藥性也逐漸增強(qiáng)，已成為抗感染治療中的最大問題，也導(dǎo)致了CAP有較高發(fā)病率和病死率，嚴(yán)重影響患者的身心健康[2]。β-內(nèi)酰胺類抗生素制劑是目前使用最普遍的治療細(xì)菌性社區(qū)獲得性感染的藥物[3]，其中AmpC β-內(nèi)酰胺酶(AmpC β-lactamases，AmpC酶)是主要β-內(nèi)酰胺酶之一，能夠介導(dǎo)革蘭陰性桿菌對新型廣譜β內(nèi)酰胺類抗生素耐藥[4-5]。高產(chǎn)AmpC酶菌株占CAP感染菌株的30%左右，高產(chǎn)AmpC酶細(xì)菌使臨床抗感染治療更加困難[6]。肺炎克雷伯菌是主要的高產(chǎn)AmpC酶菌株[7]。本文探討CAP中肺炎克雷伯菌檢出情況、耐藥性及產(chǎn)AmpC酶情況，為臨床提供參考，現(xiàn)報告如下。

1 資料與方法

1.1 研究對象

選擇2011年7月～2013年12月收治的CAP患者72例，男40例，女32例；年齡39～79歲，平均(64.31±2.19)歲；病程1月～4年，平均(1.72±0.78)年；平均體質(zhì)指數(shù)(BMI)為(24.35±2.87)kg/m2。病例納入標(biāo)準(zhǔn)：符合CAP的診斷標(biāo)準(zhǔn)，年齡<80歲，知情同意。排除有嚴(yán)重的全身疾病、糖尿病及痰液涂片質(zhì)量不合格者。

1.2 菌株鑒定及藥敏試驗

CAP患者在使用抗生素前先用無菌生理鹽水清潔口腔(無痰或者痰少患者用3%高滲鹽水霧化誘導(dǎo)痰液)，用負(fù)壓吸引器一次性吸痰管吸取咽部以下痰液進(jìn)行細(xì)菌培養(yǎng)[2]，培養(yǎng)24 h后，挑取培養(yǎng)基中可疑為病原菌的單菌落，采用法國生物梅里埃API手工鑒定卡鑒定肺炎克雷伯菌菌株。取已經(jīng)鑒定的肺炎克雷伯菌菌株于5% CO2、37 ℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，挑取單菌落細(xì)菌進(jìn)行藥敏試驗，藥敏試驗按照美國臨床實驗室國家標(biāo)準(zhǔn)化委員會(NCCLS)2012的標(biāo)準(zhǔn)， K-B法檢測肺炎克雷伯菌對頭孢吡肟、阿米卡星、亞胺培南、氨芐西林、頭孢呋辛、頭孢唑啉、環(huán)丙沙星、慶大霉素的耐藥性，質(zhì)控菌株為標(biāo)準(zhǔn)的克雷伯菌 (編號201134922)。藥敏紙片由英國OXOID公司提供，抗菌素均為購自中國藥品生物制品檢定所的標(biāo)準(zhǔn)藥物，純度都為99.99%以上，都處于有效期內(nèi)。

1.3 AmpC酶基因檢測

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)( PCR)檢測肺炎克雷伯菌中AmpC酶基因的表達(dá)，3 000 r/min離心收集肺炎克雷伯菌，采用酚氯仿法提取細(xì)菌DNA，紫外分光光度法鑒定DNA的濃度和純度。根據(jù)Amp基因的保守序列，采用引物設(shè)計軟件primer 5設(shè)計擴(kuò)增引物，正向引物序列為5′TGA TGG CAC AGC AGG ATA3′，反向引物序列為5′GGCTTTGACTCTTTCGGTA3′。 片段大小為445 bp，反應(yīng)體系為模板DNA 50 ng ，10×PCR-buffer 2.5 μL，MgCl2(2.5 mmol/L) 3 μL，dNTPs (2.5 mmol/L) 2μL，Taq DNA聚合酶1.25 U，上、下游引物(25 μmol/L)各1 μL，總體積25 μL。反應(yīng)條件為：95 ℃ 10 min，95 ℃ 15 s、60 ℃ 1 min、72 ℃ 30 s、35個循環(huán)，72 ℃ 5 min。產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳分析，并在成像系統(tǒng)中成像。

2 結(jié)果

2.1 病原菌檢測

72例患者共檢出細(xì)菌100株，革蘭陰性桿菌75株(75.0%)，肺炎克雷伯菌有30株(30%)。

2.2 肺炎克雷伯菌的耐藥性

肺炎克雷伯菌對亞胺培南無耐藥菌株產(chǎn)生，對頭孢吡肟、阿米卡星的耐藥率較低，而對青霉素類和第2、3代頭孢類藥物耐藥率均較高。見表1。

表1 肺炎克雷伯菌對不同抗菌藥物的耐藥性(n=30)

2.3 AmpC基因檢出結(jié)果

本次檢出的30株肺炎克雷伯菌中，有11株瓊脂糖電泳在445 bp出現(xiàn)單一條帶，證明共檢出AmpC陽性菌株11株(36.7%)，見圖1。

注： 1為AmpC陽性株，2為陰性對照株，M為標(biāo)準(zhǔn)分子量參照物

3 討論

流行病學(xué)研究顯示CAP是導(dǎo)致我國患者死亡的主要原因之一。CAP好發(fā)于老年人，主要由革蘭陰性菌感染引起[8]。由于老年患者生理功能的衰退使其呼吸道的異物和分泌物不易排出，且隨年齡增長免疫力降低，并且合并有多種基礎(chǔ)疾病，容易發(fā)生CAP[9]。合理選擇抗菌藥物，迅速有效地控制CAP是治療的關(guān)鍵。肺炎克雷伯菌是CAP的重要病原菌[10]。本文72例患者共檢出細(xì)菌100株，革蘭陰性桿菌75株，占75.0%，肺炎克雷伯菌有30株，占30%。表明CAP致病菌中克雷伯菌所占比例較高。

肺炎克雷伯菌對多種抗菌藥物具有天然耐藥性，產(chǎn)AmpC酶是導(dǎo)致細(xì)菌對抗菌素耐藥的主要酶類，多由普通的β-內(nèi)酰胺酶基因突變產(chǎn)生，主要由腸桿菌科細(xì)菌產(chǎn)生，呼吸道感染克雷伯氏菌也能合成[11-12]。本文在30株肺炎克雷伯菌中，檢出AmpC陽性11株，占36.7%。AmpC酶可水解青霉素類、第2、3代頭孢菌素、頭霉素類和β內(nèi)酰胺酶。由于很多酶抑制劑對AmpC酶的抑制作用較弱，加之編碼AmpC酶基因的質(zhì)粒可在不同菌屬細(xì)菌間水平傳播，因此產(chǎn)AmpC酶細(xì)菌的檢測和藥敏分析得到了廣泛重視[13]。本文結(jié)果顯示肺炎克雷伯菌對亞胺培南無耐藥菌株產(chǎn)生，對頭孢吡肟、阿米卡星的耐藥率較低，而對青霉素類和第2、3代頭孢類藥物耐藥率較高。說明肺炎克雷伯菌對大多數(shù)新型廣譜β內(nèi)酰胺類抗生素以及含酶抑制劑復(fù)合制劑均高度耐藥，但對亞胺培南和頭孢吡肟仍保持高度敏感性，對阿米卡星也有一定的敏感性。為此在臨床治療中，建議用碳青霉烯類或第4代頭孢菌素抗感染治療[14]。

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(2015-05-25收稿，2015-07-08修回)

中文編輯： 吳昌學(xué)； 英文編輯： 趙 毅

The Detection of Drug Resistance and Producing AmpC Enzyme Gene Condition ofKlebsiellapneumoniaein Community-Acquired Pneumonia

WEI Juanjuan1, SHI Xiaoyan2

(1.DepartmentofLaboratory,theTraditionalChineseMedicineHospitalofYulinCity,Yulin719000,Shaanxi,China;2.DepartmentofLaboratory,XingyuanHospitalofYulinCity,Yulin719000,Shaanxi,China)

Objective: To investigate the drug resistance and producing AmpC enzyme gene conditions ofKlebsiellapneumoniaeof community-acquired pneumonia. Methods: Sputum from 72 CAP patients was collected for Klebsiella pneumoniae, and they were given eight different kinds of drug-resistant testing, while the AmpC enzyme gene expression were detected with PCR. Results: One hundred bacteria strains were detected from 72 patients, among them 30 strains (30%) wereKlebsiellapneumoniae. TheKlebsiellapneumoniaestrains showed no drug resistance to imipenem, and showed low resistance to cefepime and amikacin, and its resistance to penicillins, second and third generation cephalosporins were higher. In 30Klebsiellapneumoniaestrains, AmpC of 11 (36.7%) strains were positive. Conclusion:Klebsiellapneumoniashows higher drug resistance to penicillins, second and third generation cephalosporins, producing AmpC enzyme gene rate is high.

community-acquired pneumonia;Klebsiellapneumoniae; beta-lactamases; drug resistance

時間：2015-08-07

http://www.cnki.net/kcms/detail/52.5012.R.20150807.2320.056.html

R563.11

A

1000-2707(2015)09-0966-03

*通信作者 E-mail:weijuanjuan_7615@163.com