鈣網蛋白片段cDNA克隆、蛋白表達及免疫學活性研究*

張麗娟， 高曉明

(蘇州大學 生物醫學研究院， 江蘇 蘇州 215123)

鈣網蛋白片段cDNA克隆、蛋白表達及免疫學活性研究*

張麗娟， 高曉明*

(蘇州大學 生物醫學研究院， 江蘇 蘇州 215123)

目的： 研究鈣網蛋白(CRT)發揮免疫生物學活性的主要功能區域。方法： 采用PCR法從CRT基因cDNA全長中擴增第150-230位編碼氨基酸所對應的核苷酸序列片段，利用分子生物學方法構建原核重組表達質粒，采用大腸桿菌表達系統進行原核表達；通過親和純化得到目的蛋白，分析目的蛋白特性；并通過體內、體外實驗對蛋白的免疫學活性進行分析。結果： 成功構建了表達CRT150-230片段(rCRT/150-230)的原核表達質粒，并從細菌裂解液上清中純化得到目的蛋白，蛋白單體通過分子間二硫鍵形成二聚體，天然狀態下形成多聚體；體外研究表明rCRT/150-230促進小鼠脾細胞的分裂，活化巨噬細胞產生一氧化氮(NO)，誘導人外周血單個核細胞產生TNF-α；體內研究表明，rCRT/150-230刺激小鼠產生高滴度抗體，該特異性抗體能識別rCRT/150-230與rCRT。結論： rCRT/150-230蛋白具有與rCRT相似的免疫活性，因此推測該蛋白片段是全長CRT發揮免疫學活性的區域。

免疫學； 鈣網蛋白； 蛋白片段； 生物學活性

鈣網蛋白(calreticulin，CRT)是一個維持機體Ca2+穩態的鈣連蛋白，CRT存在于多種生物體中，包括脊椎動物、無脊椎動物乃至高等植物[1-3]。CRT的分子量為46 kDa，由N-domain、P-domain和C-domain[4-6]3個結構域組成。CRT屬于多功能蛋白，參與了細胞中多種生物學過程，如分子伴侶、Ca2+平衡、細胞黏附、基因表達、凋亡細胞清除、抗腫瘤免疫應答等。由于CRT特殊的結構組成，研究人員對其中一些結構域或片段進行了功能研究[7-10]，但關于CRT免疫學活性的研究并未見報道。本課題組其他研究人員已經證明了CRT中存在一段高保守性片段39-272片段，在CRT中發揮免疫調節作用[11]。為了找到CRT發揮免疫調節功能更為核心的區域，本研究利用分子生物學實驗技術從CRT基因cDNA全長中擴增出從150-230位編碼氨基酸所對應的核苷酸序列片段(CRT/150-230)，并對該蛋白的免疫生物學活性進行了分析。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株與質粒 菌株E.coliDH5α與E.coliBL21(DE3)來源于天根生化公司，質粒pGEM-T來源于Promega，質粒pET28a、pET28a-CRT為本室保存。

1.1.2 細胞 脾細胞取自6～8周齡的雌性BALB/c小鼠，體重約18～20 g；腹腔巨噬細胞來源于硫代乙醇酸鈉(3%)處理3 d后的雌性C57BL/6小鼠，每只注射體積2 mL， 6～8周齡，體重18～20 g。實驗動物均由上海斯萊克動物有限公司提供。

1.1.3 酶與主要試劑 限制性內切酶、T4 DNA連接酶、T4 DNA聚合酶來源于Promega公司，質粒抽提試劑盒、DNA回收試劑盒來源于AXYGEN公司，Ni-NTA凝膠購自Novagen公司，PCR引物來源于Invitrogen公司合成。

1.2 方法

1.2.1 原核表達質粒構建 以pET28a-CRT質粒為模板，以P1(5′CGGATCCTACAAGGGCAAGAATGTGCTGAT3′)、P2(5′CCCAAGCTTCTAATCTGTGGGGTCATCGATCTTG3′)為引物通過PCR擴增CRT片段150～230序列，將片段連接至pGEM-T Vector，轉化至克隆菌DH5α中，從正確的克隆菌中抽提質粒進行酶切，將酶切出的目的片段連接至pET28a質粒中，轉化至克隆菌DH5α中，鑒定正確后，抽提質粒轉化至表達菌BL21中。

1.2.2 rCRT/150-230蛋白表達 將攜帶目的基因序列的重組質粒轉化至BL21感受態中，從卡那霉素(Kana,100 mg/L)瓊脂糖平板上篩選陽性克隆，挑取平板上單克隆接種于Kana培養基LB中，37 ℃培養6～8 h，轉接一次新鮮的LB，37 ℃培養至OD600為0.6～0.8，以終濃度0.1 mmol/L的IPTG為誘導條件，培養5 h即可。

1.2.3 蛋白親和純化 擴增培養重組表達菌，收集菌體并將其懸浮于1×緩沖液(5 mmol/L咪唑緩沖液)中，冰水中超聲破碎(工作時間與間歇時間各3 s，功率為200 W，每次時間為20 min，共3次)，離心收集裂解液上清，純化前用0.000 45 mm 濾膜過濾，并與Ni-NTA柱室溫顛倒孵育2 h，重新裝柱，用1×binding buffer將雜蛋白沖洗凈，用300 mmol/L咪唑緩沖液將目的蛋白洗脫出來。

1.2.4 脾細胞增殖實驗 引頸處死BALB/c，于超凈臺取脾并研磨成單細胞懸液，ACK裂解紅細胞，用RPMI-1640培養液(10%胎牛血清)將單細胞懸液調為5×106cell/mL細胞數加入96孔細胞培養板中，實驗孔中加入一定濃度的蛋白樣品，對照孔加入等體積的培養基， 37 ℃ 5% CO2培養，48 h后無菌加入0.02 mL 噻唑藍(濃度為5 mg/mL)，反應4 h后離心棄上清，加入0.15 mL DMSO，振蕩10 min，檢測OD 492 nm吸光度值。

1.2.5 腹腔巨噬細胞活化實驗 取C57BL/6小鼠，每只小鼠腹腔注射2 ml 3%硫代乙醇酸鈉，第3 天將小鼠引頸處死，無菌PBS灌洗小鼠腹腔，提取腹腔巨噬細胞(一般情況下不需使用ACK裂解紅細胞)，用培養液將細胞濃度調至1.5×106/mL，置于96孔培養板中，實驗組中加入一定濃度的蛋白樣品，對照組加入等體積的培養基，于恒溫培養箱中培養24 h后取上清液，測定其NO含量。

1.2.6 人外周血單個核細胞刺激實驗 取正常人外周血，用淋巴細胞分離液無菌分離出單個核細胞，將細胞濃度調為5×106/mL加入96孔培養板中，實驗組為一定濃度的蛋白樣品，對照組為等體積的培養基，恒溫培養箱中培養，12 h后取細胞培養上清，測定其TNF-α含量。

2 結果

2.1 rCRT/150-230原核表達載體構建

以pET28a-CRT質粒為模版，PCR法擴增rCRT/150-230 CDNA(圖1A)，將該片段與pGEM-T Vector連接并測序成功后，經BamHI和HindⅢ 雙酶切鑒定(圖1B)，將酶切產物連接至pET28a，并轉化至克隆菌DH5α中，挑取單克隆進行菌體PCR鑒定，得到大小與預期一致片段(圖1C)，提取質粒并轉化到表達菌株BL21中，經菌體PCR鑒定，重組質粒構建成功。

注：A為PCR擴增產物，B為雙酶切鑒定結果(1為酶切質粒，2為未酶切質粒)，C為菌體PCR鑒定(1為rCRT/150-230菌PCR，2為空白對照)

2.2 rCRT/150-230蛋白表達及純化

將構建好的原核重組表達菌株，于37 ℃，0.1 mmol/L IPTG條件下進行大量擴增及誘導表達，從細菌裂解液上清中檢測到目的蛋白(圖2A)，采用親和層析法，提取目的蛋白(圖2B)。

注：A為蛋白表達(1為未誘導菌液，2為誘導菌液上清，3為誘導菌液包涵體)，B為蛋白純化(1為裂解上清液，2為流穿液，3為洗滌液，4為洗脫液)

2.3 rCRT / 150-230理化特性分析

對rCRT / 150-230及實驗室原有的原核表達的CRT片段蛋白(rCRT/39-272，rCRT/120-250)進行理化特性分析，結果表明，CRT片段150-230蛋白純度不低于90%。 Native-PAGE及SDS-PAGE跑膠結果顯示，在自然狀態下rCRT/150-230以多聚體的形式存在(圖3A)，在沒有還原劑2-ME存在的條件下，rCRT/150-230以二聚體形式存在(圖3B)。標簽蛋白部分并無半胱氨酸存在，排除重組蛋白rCRT/150-230兩端的標簽蛋白對蛋白理化性質的影響，說明蛋白存在分子間二硫鍵。

注：A為非變性膠鑒定(1為rCRT，2為rCRT/120-250，3為rCRT/150-230，4為rEGFP)， B為SDS-PAGE膠鑒定(1為rCRT/39-272，2為rCRT/120-250， 3為rCRT/150-230，4為 rEGFP)

2.4 rCRT/150-230免疫學活性

細胞實驗鑒定目的蛋白的免疫學活性，結果表明，rCRT/150-230可有效促進脾細胞增殖(圖4A)，還能夠刺激小鼠腹腔巨噬細胞分泌NO(圖 4B)，并且能夠刺激正常人外周血單個核細胞(PBMC)分泌TNF-α(圖4C)，并且刺激效果與全長CRT無顯著差異。rCRT/150-230、rCRT組與rEGFP及空白對照組相比差異有統計學意義。

2.5 rCRT/150-230免疫原性

通過體內實驗鑒定原核蛋白的免疫原性。結果顯示，rCRT/150-230可使小鼠體內產生高滴度的抗rCRT/150-230特異性抗體(圖 5A)，并且該抗體能夠識別rCRT蛋白(圖 5B)，說明該蛋白具有良好的免疫原性。

注：A為小鼠脾細胞增殖實驗，B為小鼠腹腔巨噬細胞刺激實驗，C為人外周血單個核細胞刺激實驗；與對照組比較，(1)P<0.05,(2)P<0.01,(3)P<0.001

注：A為rCRT/150-230免疫血清抗體效價測定，B為rCRT/150-230血清抗體識別rCRT

3 討論

CRT最早是從肌漿網中分離得到的一種Ca2+結合蛋白，在維持Ca2+穩態中發揮重要作用。隨著研究不斷深入，有學者發現CRT是一個多功能保守蛋白，廣泛存在于生物體中，不僅存在內質網中發揮作用，在細胞膜及胞外都參與了生物學過程，膜型CRT在清除機體內凋亡的細胞及抵御腫瘤的免疫過程都發揮了重要作用[12-13]； 胞外也檢測到可溶性CRT，尤其在類風濕性關節炎(RA)患者的血清和關節液中檢測到了可溶性CRT的存在，而健康人中未檢測到CRT[11]。Tarr等[14]研究發現，RA患者的血清及關節液中可溶性CRT與疾病活動度指標相關，提示了可溶性CRT在臨床應用中可作為一個新的診斷指標或藥物靶標。由于CRT具有與熱休克蛋白相似的免疫學活性[15]，被認為是廣義熱休克蛋白家族的一員，參與機體的固有免疫系統和適應性免疫系統。本研究前期結果證實了可溶性CRT的免疫學活性，并且將CRT發揮免疫學活性的功能片段確定為39-272[11], 在實驗室前期研究基礎之上，本研究對CRT的功能片段進行更精確的研究。

本研究通過分子生物學方法，經PCR擴增出CRT片段150-230，成功構建rCRT/150-230原核表達質粒。結果表明，rCRT/150-230在原核表達菌中大部分以可溶性形式存在，不易降解，便于純化。根據rCRT/150-230的氨基酸組成，分子內存在一個半胱氨酸，理論上可形成分子間二硫鍵，在維持二硫鍵自然存在的情況下，該蛋白是以二倍體的形式存在，與預期相符。對純化得到的蛋白進行體內、體外實驗檢測其免疫生物學活性，體外細胞實驗顯示150-230片段蛋白促進了脾細胞分裂、誘導巨噬細胞產生NO、誘導人外周血單個核細胞產生細胞因子TNF-α。rCRT/150-230，這些生物學特性與Hong等[11]報道的rCRT/39-272的生物學活性相似。Huang等[16]研究表明，CRT的生物學活性受到蛋白寡聚化或多聚化程度的影響，多聚體形式的rCRT比單體形式的rCRT有更強的生物學活性，而自然狀態下，Native-PAGE則顯示rCRT/150-230是以多聚體的形式存在，其表現出較強的免疫生物學活性。本研究體內實驗表明，150-230片段蛋白誘導小鼠發生體液免疫應答，產生高滴度的抗150-230片段蛋白與全長CRT抗體，即蛋白150-230片段具有很強的免疫刺激效果，與全長CRT相當。

本研究結果表明rCRT/150-230區域是CRT的主要免疫學活性區域，能否找到CRT更小的功能區域還有待進一步研究。

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(2015-04-18收稿，2015-05-26修回)

中文編輯： 劉 平； 英文編輯： 趙 毅

A Study of cDNA Cloning, Protein Expression and Immunological Activity of Calreticulin Fragment

ZHANG Lijuan， GAO Xiaoming

(InstituteofBiologyandMedicineSciences,SoochowUniversity,Suzhou215123,Jiangsu,China)

Objective: To investigate the major functional areas of calreticulin (CRT) that exerts immunobiological activity. Methods: Amplified a 150-230 fragment of rCRT and constructed a prokaryotic expression vector by molecular biology method. Then adopted E.Coli to express the protein which was purified by affinity purification. The biochemical property of rCRT/150-230 was tested. Analyzing the immunobiological activity of this proteininvitroandinvivo. Results: rCRT/150-230 protein was purified from the bacterial lysate supernatant, and it had good solubility and existed as polymer in nature. rCRT/150-230 could effectively stimulate the proliferation of mice spleen cells, and activate the secretion of NO of mice macrophage, and stimulate human peripheral blood mononuclear cells to secrete TNF-α, and has strong immunogenicity that induces the process of humoral immune response in mice. Conclusion: rCRT/150-230 appears similarity immunobiologic functions with rCRT, it could be inferred that it might be the major functional area of rCRT.

immunology； calreticulin； protein fragment； biological activity

時間：2015-08-07

http://www.cnki.net/kcms/detail/52.5012.R.20150807.2241.014.html

R34-33

A

1000-2707(2015)09-0954-05

*通信作者 E-mail:xmgao@suda.edu.cn