姜黃素對宮頸癌荷瘤裸鼠的抑瘤作用*

游贛花， 羅 俊， 張學愈， 潘年松**， 張 玨， 張衛霞， 涂銘旌， 盛 勇

(1．貴州省食品藥品檢驗所 藥理毒理室， 貴州 貴陽 550004； 2．貴州醫科大學 藥理教研室， 貴州 貴陽 550004； 3．遵義醫藥高等專科學校 天然藥物教研室， 貴州 遵義 563002； 4.四川大學 材料學院， 四川 成都 610065)

姜黃素對宮頸癌荷瘤裸鼠的抑瘤作用*

游贛花1， 羅 俊2， 張學愈3， 潘年松3**， 張 玨3， 張衛霞2， 涂銘旌4， 盛 勇4

(1．貴州省食品藥品檢驗所 藥理毒理室， 貴州 貴陽 550004； 2．貴州醫科大學 藥理教研室， 貴州 貴陽 550004； 3．遵義醫藥高等專科學校 天然藥物教研室， 貴州 遵義 563002； 4.四川大學 材料學院， 四川 成都 610065)

目的： 探討姜黃素對宮頸癌Hela細胞荷瘤裸鼠的抑瘤作用。方法： 40只雌性裸鼠腋下接種Hela細胞構建荷瘤模型，隨機分為姜黃素低、中、高劑量組、5-氟尿嘧啶(5-Fu)組及模型組，分別腹腔注射壓榨法提取姜黃素60、120、240 mg/kg，5-Fu 20 mg/kg及等量生理鹽水，0.2 mL/只， 隔天1次，連續給藥10次；觀察腫瘤生長情況、抑瘤率、病理組織學改變，檢測細胞周期及凋亡率。結果： 姜黃素低、中、高劑量組的抑瘤率分別為20.14%，32.43%，59.56%，呈劑量依賴性升高；病理切片可見姜黃素給藥組細胞核固縮、裂解，腫瘤組織內有炎性細胞浸潤，纖維結締組織增生明顯，血管數量減少；姜黃素各給藥組的腫瘤細胞凋亡率為12.79%， 16.23%，21.90%，較模型組明顯增加(P<0.05)， 且腫瘤細胞主要被阻滯于G2/M期。結論： 壓榨法提取姜黃素可顯著抑制宮頸癌裸鼠移植瘤的增殖，其機制可能與姜黃素誘導癌細胞凋亡有關。

姜黃素； 宮頸腫瘤； 癌； 裸鼠； 凋亡

宮頸癌是發生在宮頸陰道部或移行帶的鱗狀上皮細胞與宮頸管內膜的柱狀上皮細胞交界處的惡性腫瘤，全球每年約9%的女性新發癌癥病例為宮頸癌，約8%的女性癌癥患者死于此病[1]。因此，研究安全有效的宮頸癌治療方法和抗癌藥物具有重要意義。姜黃素是從姜科姜黃屬植物姜黃、莪術、郁金等的根莖中提取的一種天然有效成分，對前列腺癌PC-3細胞、頭頸癌Cal27細胞、乳腺癌MCF-7細胞等均有明顯抑制作用[2-4]，但關于姜黃素對宮頸癌Hela細胞的作用及其機制方面的研究報道較少。本研究建立宮頸癌裸鼠模型，使用姜黃素干預，觀察抑瘤率、腫瘤細胞病理形態改變及凋亡情況，研究姜黃素對宮頸癌荷瘤裸鼠的抑瘤作用。

1 材料和方法

1.1 材料

Balb/c雌性裸鼠40只，3～4周齡，體重14～16 g，購自中科院實驗動物中心湖南分中心，合格證編號HNASLKJ20113600，飼養于貴陽醫學院動物中心無特定病原體(SPF)的動物隔離器內，溫度22～26 ℃，相對濕度40%～60%，明暗各12 h。溫莪術購于四川省崇州市雙郁金合作社，經鑒定確認。5-氟尿嘧啶(10 mL/支，天津金耀氨基酸有限公司)，姜黃素標準品(貴州迪大科技有限責任公司，含量≥98%，批號201104)。

1.2 藥品制備

溫莪術鮮品壓榨藥渣(已用壓榨法去油)：經折干率和壓榨率計算，183.00 g溫莪術鮮品壓榨藥渣相當于溫莪術藥材干品80.00 g，加入15倍質量分數80%的乙醇，水浴回流1.5 h，用微孔濾膜抽濾后再提取一次。合并乙醇提取液，于旋轉蒸發器上回收溶劑至乙醇提取液成稠膏(約100 mL)；在稠膏中加入95%的乙醇400 mL，超聲提取0.5 h后用微孔濾膜抽濾，提取2次(第2次加入95%的乙醇100 mL)，合并濾液后于旋轉蒸發器上蒸干溶劑，收集壓榨后的姜黃素膏于棕色瓶中，揮干溶劑后密閉，室溫避光保存。經高效液相色譜儀鑒定，姜黃素含量為1.20 mg/g。

1.3 動物建模及分組給藥

于裸鼠左側腋窩皮下注射Hela細胞懸液(3×106個/只，0.2 mL)，共接種40只。7 d后接種Hela細胞的裸鼠均出現直徑大約5 mm的皮下結節，移植瘤模型建立。接種后第8 天將已建立皮下移植瘤模型的40 只裸鼠隨機分為5 組(n=8)：姜黃素低、中、高劑量組(60 mg/kg、120 mg/kg、240 mg/kg)，模型組，5-Fu組(20 mg/kg)，腹腔注射給予相應藥物，0.2 mL/只，模型組同法給予等量生理鹽水， 隔天1次，連續給藥10次。

1.4 觀察指標

隔天測量1 次裸鼠體重、腫瘤的最大徑(a)和最小徑(b)，并根據公式：V=ab2/2(單位mm3)計算腫瘤體積。結束治療后第2 天，所有裸鼠摘眼球取血處死，完整剝出瘤組織并精確稱重。計算抑瘤率，公式為：(1-治療組平均瘤重/模型組平均瘤重)×100%。切取小塊瘤組織標本，10%中性甲醛固定、脫水，常規石蠟包埋，并制成4 μm的切片行HE染色，光鏡下進行病理學觀察。瘤體標本制成約0.5 mm×0.5 mm大小，PBS洗兩遍，機械粉碎，過濾，制成細胞懸液；PBS離心，洗兩遍，75%乙醇5 mL，4 ℃固定過夜，PBS洗兩遍，取約為1×106/mL細胞1 mL，加0.5 g/L碘化丙啶(PI)溶液1 mL，避光染色30～45 min，上流式細胞儀進行細胞周期和凋亡的檢測。

1.5 數據統計

2 結果

2.1 瘤重和瘤體積

姜黃素各劑量組瘤重、瘤體積與模型組比較明顯降低(P<0.05)，隨給藥劑量的增加，姜黃素各劑量組裸鼠瘤重減輕，差異有統計學意義(P<0.05)； 姜黃素低、中、高劑量組的抑瘤率呈劑量依賴性升高。見表1。

表1 姜黃素對荷瘤裸鼠瘤重、瘤體積的影響(n=8)

(1)與模型組比較，P<0.05；(2)與上一組比較，P<0.05

2.2 病理學改變

病理切片結果顯示，姜黃素各給藥組隨劑量的增加，可出現炎性細胞浸潤，細胞核固縮、裂解，血管數量顯著減少，纖維結締組織增生，以及瘤床內片狀壞死等形態學改變。5-Fu組細胞內可見大量空泡，細胞核固縮、裂解，腫瘤組織內有較多的壞死組織和炎性細胞浸潤，有出血灶及明顯的纖維化形成。模型組可見病理性核分裂象，細胞被纖維組織分隔成大小不等的癌巢，組織外層可見較多新生血管。見圖1。

注：A為模型組，B為姜黃素低劑量組，C為姜黃素中劑量組，D為姜黃素高劑量組，E為5-Fu組

2.3 腫瘤組織細胞周期和凋亡率

姜黃素各劑量組G0/G1細胞比模型組少，其中高劑量組與模型組比較差異有統計學意義(P<0.05)；姜黃素各劑量組S期細胞比模型組少，中、高劑量組與模型組比較差異有統計學意義(P<0.05)；姜黃素各劑量組G2/M期細胞比模型組多，且細胞主要阻滯于G2/M期，其中高劑量組與模型組比較差異有統計學意義(P<0.05)；姜黃素各劑量組細胞凋亡率較模型組明顯升高(P<0.05)，且姜黃素隨給藥劑量的增加，細胞凋亡率亦隨之增加(P<0.05)。見表2。

表2 姜黃素對荷瘤裸鼠腫瘤組織的細胞周期和凋亡率的影響(%，n=8)

(1)與模型組比較，P<0.05；(2)與上一組比較，P<0.05

3 討論

姜黃素的抗腫瘤作用于1985年由印度學者Kuttan首次提出，并逐漸成為國內外學者研究的熱點。姜黃素可以用于防治腫瘤，對多種腫瘤細胞的產生、增殖、轉移均有抑制作用，如結腸癌、胃癌、白血病等。姜黃素可以作為抗突變劑和抗癌劑，美國國立腫瘤研究所已將其列為第3代癌癥化學預防藥，有希望成為一種具有廣泛應用前景的抗癌新藥。

本課題的前期研究表明，姜黃素在體外能夠顯著抑制Hela細胞株的生長，且發現姜黃素的4種提取方法中壓榨法提取的姜黃素體外抑瘤效果最好。本實驗結果表明，姜黃素各劑量組均有較好的抑瘤效果，姜黃素低、中、高劑量組瘤重及瘤體積依次降低，抑瘤率依次升高，且呈現劑量依賴性；病理切片可見在不同劑量姜黃素作用下，瘤細胞出現不同程度的核固縮、凋亡小體形成等形態學改變；流式細胞儀檢測到凋亡峰，細胞凋亡率12.79%～21.90%，且隨給藥劑量的增加，細胞凋亡率亦隨之增加；S期細胞減少，同時G2/M期細胞增多,上述結果均表明，誘導宮頸癌Hela細胞凋亡可能是姜黃素的抗腫瘤機制之一。

自1972年由Kerr[5]等首先提出凋亡概念并對其形態進行了描述。隨后人們在對凋亡形態、基因蛋白調控等方面開展了大量的研究，并發現腫瘤的發生與細胞增殖和細胞凋亡異常相關[6]，通過誘導腫瘤細胞凋亡是藥物發揮抗腫瘤作用的一個重要機理[7-8]。本課題組將進行凋亡相關基因表達及相關信號轉導通路方面的研究，進一步探索姜黃素發揮抗腫瘤作用的機制。

[1] Jemal A，Bray F，Center MM，et al．Global cancer statistics[J]．CA Cancer Clin， 2011 (2)：869-901．

[2] Wei X，Zhou D，Wang H，et al．Effects of pyridine analogs of curcumin on growth，apoptosis and NF-κB activity in prostate cancer PC-3 cells[J]．Anticancer Res， 2013 (4) ：1341-1350．

[3] Xi Y，Gao H，Callaghan MU，et al．Induction of BCL2-Interacting Killer，BIK, is mediated for anti-cancer activity of curcumin in human head and neck squamous cell carcinoma cells[J]．J Cancer, 2015 (4)：327-332．

[4] Li Q,Chen J,Luo S，et al．Synthesis and assessment of the antioxidant and antitumor properties of asymmetric curcumin analogues[J]. Eur J Med Chem, 2015(3)：461-469．

[5] Kerr JF, Wyllie AH, Currie AR. Apoptosis:a basic biological phenomenon with wide ranging implication in tissue kinetics[J].Br J Cancer, 1972(4)：239-257.

[6] Kamesaki H. Mechanisms involved in chemotherapy-induced apoptosis and their implications in cancer chemotherapy[J]. Int J Hematol， 1998(1)：29-43．

[7] Yang L, Cui Y,Shen J，et al．Antitumor activity of SA12, a novel peptide, on SKBr-3 breast cancer cells via the mitochondrial apoptosis pathway[J]. Drug Des Devel Ther, 2015 (9)：1319-1330.

[8] Choi DW, Lim MS, Lee JW，et al. The cytotoxicity of Kahweol in HT-29 human colorectal cancer cells is mediated by apoptosis and suppression of heat shock protein 70 expression[J]. Biomol Ther (Seoul), 2015(2)：128-133.

(2015-05-20收稿，2015-06-30修回)

中文編輯： 吳昌學； 英文編輯： 趙 毅

Anti-Tumor Effects of Curcumin on Cervical Cancer Tumor-bearing Nude Mice

YOU Ganhua1， LUO Jun2， ZHANG Xueyu3， PAN Niansong3， ZHANG Jue3， ZHANG Weixia2， TU Mingjing4， SHENG Yong4

(1．DepartmentofPharmacologyandToxicology,GuizhouInstituteforFoodandDrugControl,Guiyang550004,Guizhou，China；2．DepartmentofPharmacology，GuizhouMedicalUniversity,Guiyang550004,Guizhou，China；3．DepartmentofNaturalMedicine,ZunyiMedicalandPharmaceuticalCollege,Zunyi563002,Guizhou，China；4．CollegeofMaterial，SichuanUniversity,Chengdu610065,Sichuan，China)

Objective: To investigate the anti-tumor effects of curcumin on nude mice with cervical cancer. Method: Forty nude female mice were inoculated Hela cells in axillary skin, and dividing into five groups randomly: the low, medium, high dose group of curcumin (60 mg/kg, 120 mg/kg, 240 mg/kg), the 5-Fu group and the model group. Then, injecting the curcumin, which from pressing 60, 120, 240 mg/kg, 5-Fu 20 mg/kg and equal amount of normal saline into mice with intraperitoneal injection way, 0.2 mL for each at the frequency of one time every other day for 10 times. The tumor growth，anti-tumor rate and histopathology were observed. Meanwhile, the cell cycle and apoptosis rate were also detected. Results: The anti-tumor rates of the low, medium, high dose groups of curcumin were 20.14%，32.43%，59.56% respectively, which indicated dose-dependent；according to the results of pathological section, these groups curcumin cell nucleus pyknosis，lysis，meanwhile the inflammatory cell infiltration in tumor tissue，and the proliferation of fibrous connective tissue was significantly, however the number of blood vessels decreased. The flow cytometry results showed that the tumor cell apoptosis rates of the low，medium，high dose groups of curcumin were 12.79%，16.23%， 21.90%. Comparing with the model group, they were increased significantly (P<0.05) ， and most of tumor cell was blocked in the G2/M phase. Conclusion: Curcumin from pressing can inhibit the cervical cancer proliferation in nude mice significantly,the mechanism may be rlated to the apoptosis of cancer cells induced by curcumin.

curcumin； cervix neoplasms; carcinoma； nude mice； apoptosis

貴州省教育廳自然科學研究項目[黔教科(2009)0101號]； 貴州省科技計劃項目[黔科合SY(2008)3027]

時間：2015-08-07

http://www.cnki.net/kcms/detail/52.5012.R.20150807.2228.002.html

R979.1

A

1000-2707(2015)09-0915-04

**通信作者 E-mail:783044500@qq.com