熒光定量基因擴增法與萋-尼抗酸染色法檢測結核分枝桿菌的比較

趙晶 葛存興 王宏志 余敏紅 馬海玲

熒光定量基因擴增法與萋-尼抗酸染色法檢測結核分枝桿菌的比較

趙晶 葛存興 王宏志 余敏紅 馬海玲

目的 對熒光定量基因擴增法(FQ-PCR法)和萋-尼抗酸染色法檢測結核分枝桿菌的準確性和陽性率進行比較。方法 88例肺結核患者的痰標本, 分別用FQ-PCR法和萋-尼抗酸染色法進行檢測。對比兩種方法的檢測結果。結果 FQ-PCR法有55例陽性, 檢出率為62.5%, 萋-尼抗酸染色法檢測有20例陽性, 檢出率為22.7%, 明顯低于FQ-PCR法。結論 在檢測結核分枝桿菌的方法中, FQ-PCR法的檢出率明顯高于萋-尼抗酸染色法的檢出率, 所以在臨床診療工作當中, 臨床醫生應該更多選擇FQ-PCR法檢測結核分枝桿菌, 以便在肺結核的早期診斷和早期治療中發揮更大的作用。

熒光定量基因擴增法；萋-尼抗酸染色法；結核分枝桿菌

結核病是青少年人容易發生的一種慢性和緩發的傳染病, 一年四季都可以發病, 15～35歲的青少年是結核病的高發峰年齡。潛伏期4～8周, 其中80%發生在肺部, 人與人之間呼吸道傳播是結核病傳染的主要方式, 人體感染結核病后不一定發病, 當抵抗力降低或細胞介導的變態反應增高時,才可能引起臨床發病, 若能及時診斷并給予合理的治療, 大多可獲得臨床痊愈。目前從痰標本中檢測出結核分枝桿菌仍是臨床診斷是否感染肺結核的重要方法之一, 因此及時發現結核分枝桿菌對該病的早期診斷, 及早用藥治療都重要的作用。本文對88例肺結核患者的痰標本分別用FQ-PCR法和萋-尼抗酸染色法檢測結核分枝桿菌, 并對兩種方法的檢出率進行評價, 現將結果報告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 88例痰標本全部來自本院住院肺結核患者, 88例患者已經根據癥狀、影像學、細胞學等指標確診為肺結核感染。其中男50例, 女38例。樣本留取時要求患者在清晨用清水漱口后, 從深喉部咳出痰1～2口放入一次性無菌痰盒中, 加蓋送檢。注意痰標本應避免混入吐沫, 最好是干酪樣或膿樣黏痰。

1.2 試劑與儀器 熒光定量基因擴增分析儀為ABI7300型,使用的配套試劑均由中山大學達安基因公司提供, 痰萋-尼抗酸染色法采用珠海貝索生物技術公司的成套試劑 。

1.3 方法

1.3.1 FQ-PCR法 將送檢的痰標本按結核分枝桿菌特異性基因檢測試劑盒說明書操作步驟進行操作, 最后放入ABI7300分析儀, 按說明書設置好反應參數進行擴增檢測,進行30個循環后, 利用軟件建立標準曲線自動分析每一個標本的拷貝數, 判斷結果。

1.3.2 痰萋-尼抗酸染色法 用無菌棉簽挑取干酪樣或膿樣黏痰, 在2張玻片上均勻涂抹, 可以適當增加涂片的厚度,自然干燥后, 在酒精燈外焰上反復穿過2～3次固定, 按照操作規程進行萋-尼抗酸染色法染色, 染色自然晾干后鏡檢,在藍色背景下尋找被染成紅色的結核分枝桿菌。2張涂片當中只要有一張查到結核分枝桿菌為陽性。

2 結果

88例結核患者痰樣本用FQ-PCR法和萋-尼抗酸染色法檢測結核分枝桿菌檢出率比較, 見表1。

表1 兩種方法檢測88例痰標本中結核分枝桿菌陽性率比較(n, %)

3 討論

結核病是一個全球性的問題, 近年來在世界范圍內廣泛流行, 且呈增長的趨勢, 全球1/3約20億)已感染了結核分枝桿菌, 如不采取措施今后10年內還將有3億人受結核菌(tubercle bacillus, TB)感染。當前, 結核病的死亡率達歷史最高水平, 全球每年約200萬人死于結核病。特別是在發展中國家, 其發病率較高, 危害性極大, 98%的死亡患者和95%的新發患者都在發展中國家, 隨著艾滋病的流行, 其并發癥肺結核的問題也日益嚴重［1］。我國結核病的疫情也非常嚴峻,我國結核病患者的數量位居世界第二位, WHO在最近公布的結核病疫情資料中顯示, 我國已成為需要引起特別警示和關注的國家和地區之一。我國衛生部門發布的傳染病疫情報告中提到, 目前肺結核的發病例數和死亡例數均居我國現有法定傳染病的第二位, 與以往相比, 近幾年結核病的發病率呈明顯上升現象。由此可見, 我國目前結核病尚未得到有效控制, 作為醫務人員在結核病的早期預防和診療的工作任務仍然十分艱巨。

結核病的實驗室檢查常見的有直接涂片查找抗酸桿菌、培養法、血清抗體檢查及FQ-PCR法, 確診需要結合接觸史,臨床癥狀, 影像學檢查［2］。直接涂片萋-尼抗酸染色法查找結核分枝桿菌優點是簡便、廉價、不需要特殊儀器設備, 適合基層醫院實驗室開展, 缺點是陽性率低, 靈敏度差, 本文的檢出率也只有22.7%, 由于涂片陽性率低致使大量結核病患者漏診或誤診, 嚴重影響了臨床診治的需要。

PCR是一種根據DNA復制原理設計的體外DNA或RNA擴增方法, 自1989年引入結核病的診斷以來, 很快成為結核病診斷領域中備受關注的焦點。熒光實時定量PCR技術是一種先進的PCR產物量化檢測技術, 能夠對PCR擴增的每一個循環進行實時監控, 這種方法將先進的光學設備、溫控技術、熒光素標記技術以及計算機有機結合, 具有較高的敏感性和特異性, 而且能夠消除普通PCR的平臺效應的影響。目前已廣泛用于目的基因的定量檢測, 熒光定量PCR技術的獨特優勢有：①由于多使用了一條熒光探針, 可由擴增分析儀自動收集熒光信號, 避免了主觀判斷的誤差, 所以特異性更強, 靈敏度更高。②完全封閉的反應系統, 可以減少污染, 確保了檢測結果的可靠性。③采用對數分析, 定量結果更準確可靠定量范圍廣。④可實現單管雙檢或多檢, 還可設計針對性內標, 以排除抑制劑干擾。本文結果表明88例結核患者送檢的痰標本用FQ-PCR法檢測其中55例呈現陽性結果, 檢出率62.5%遠遠高于痰涂片萋-尼抗酸染色法的22.7%, 這與國內其他文獻的相關報道基本相似［3］。

綜上所述, FQ-PCR法是檢測結核分枝桿菌感染靈敏度和檢出率都比較高的一種方法, 對早期診斷、合理治療結核病有很大的幫助, 所以在臨床診療工作當中, 臨床醫生應該更多選擇FQ-PCR法檢測結核分枝桿菌取代痰涂片萋-尼抗酸染色法檢測結核分枝桿菌。

［1］ Dye C, Scheele S, Dolin P, et al.Global burden of tuberculosis; estimated incidence, prevalence and mortality by country.JAMA, 1999(282):677-686.

［2］ 周為鴻.結核診斷金標準探討.國際檢驗醫學雜志, 2010, 31(3):260.

［3］ 張翊, 盧建平, 葉淼.四種結核分枝桿菌檢測方法的臨床應用評價.中國防癆雜志, 2006, 28(1):14-17.

10.14163/j.cnki.11-5547/r.2015.03.045

2014-10-16］

163316 大慶市人民醫院檢驗科