大鼠下肢擠壓傷模型不同擠壓時間的生化指標觀察

鄒圣強，潘 鑫，魏 超，蘇兆亮，王一鏜

大鼠下肢擠壓傷模型不同擠壓時間的生化指標觀察

鄒圣強1，2，潘 鑫1，魏 超1，蘇兆亮1，王一鏜3

目的 探討不同擠壓時間后大鼠相關生化指標的變化。方法 2月齡健康SD大鼠48只，體重160～200 g，隨機分為實驗組(n=40)和對照組(n=8)。其中實驗組分為擠壓4、6、12、24、48 h等5組，每組各8只大鼠。預定擠壓時間到達解除負重后4 h觀察大鼠雙下肢改變，眼眶采血行血生化檢測。結果 擠壓期間實驗組共7只大鼠死亡，解除壓迫后，存活大鼠雙下肢腫脹明顯，不能正常活動；實驗組大鼠血清的丙氨酸氨基轉移酶(alanine aminotransferase，ALT)、天門冬氨酸氨基轉移酶(aspartate aminotransferase， AST)、尿素氮(blood urea nitrogen,BUN)、肌酸激酶(creatine kinase，CK)水平與對照組比較差異有統計學意義(P<0.05)，而肌酐(creatinine,Cr)、K+水平實驗組與對照組比較差異無統計學意義(P>0.05)。結論 不同擠壓時間對大鼠的生化指標有不同影響。

擠壓傷； 再灌注； 大鼠模型

擠壓傷(crush injury)包括擠壓綜合征、筋膜間室綜合征和急性外傷性缺血，會引起出血、水腫及低灌注導致的局部低氧和缺血[1]。擠壓傷在人群踩踏事件的傷員中常見，廣義指機體任何一個部位受到擠壓，使組織結構的連續性受到破壞和功能障礙。但是臨床上所提的擠壓傷特指人體肌肉豐富的部位，如四肢、軀干，受壓榨或擠壓后所造成的損傷。通常受壓肌肉組織大量變性、壞死，組織間隙滲出、水腫。表現為受壓部位的腫脹，感覺遲鈍或喪失，運動障礙，以及肌紅蛋白血癥和一過性肌紅蛋白尿。與此相關的另一個概念就是擠壓綜合征(crush syndrome, CS)，通常指傷員肢體被長時間持續擠壓后，肢體發生創傷性橫紋肌溶解，當擠壓解除后傷員出現以肢體腫脹、肌紅蛋白尿、高血鉀、急性腎衰竭為主要臨床表現的一系列癥狀。

近年因地震、車禍等意外事件發生頻繁，出現擠壓傷-擠壓綜合征的傷員也呈逐步增多趨勢，并保持著較高的發病率和病死率[2-5]。目前，日益增多的高層建筑倒塌和突發群體性踩踏事件，也是擠壓傷發生率增至40%的原因之一[6]，導致的病死傷員中發生擠壓綜合征的占20%[7]。在2008年汶川發生的8級大地震中，共有6.9萬人遇難,受傷37.4萬人,其中95%的傷亡是源于建筑物坍塌引起的砸傷和擠壓傷[8]。因此擠壓傷-CS成為災害醫學救援及臨床研究的熱點課題。本研究通過動物實驗，觀察大鼠雙下肢擠壓傷后不同時間生化指標的變化，為擠壓傷的診治提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料 2月齡健康SD大鼠48只，雌雄不限，體重160～200 g，由江蘇大學實驗動物中心提供[生產許可證號：SCXK(蘇)2013-0011]。飼養環境：保持環境清潔，動物實驗室溫度、濕度適宜，通風良好。每8只大鼠飼養于1個大籠中，自由進食飲水。

1.2 大鼠雙下肢擠壓傷模具 采用由四川成都東成機械有限公司生產的大鼠雙下肢擠壓傷模具。此模具由動物固定臺、連接柱、固定柱、承重板等組成。動物固定臺長40 cm、寬20 cm、高2 cm。固定臺中部開有2排孔，每排各6個，可根據實驗動物大小放置U形固定架。固定臺底邊裝有3 cm可拆卸固定柱。承重板由不透明硬質塑料板制成，長20.0 cm、寬17.8 cm、高0.6 cm，兩邊開有大小為11.5 cm×1.2 cm的條形槽，方便放置金屬柱螺桿(高 10 cm)。

1.3 實驗儀器及試劑 Beckman Coulter AU5800全自動生化分析儀(美國Beckman Coulter公司)；5417R臺式高速冷凍離心機(德國Eppendorf公司)；奧林巴斯BX53顯微鏡(日本OLYMPUS公司)；鉀離子測定試劑盒(Beckman Coulter 配套AU生化分析系統專業電解質參比液)；ALT測定試劑盒、AST測定試劑盒、CK測定試劑盒(浙江夸克生物科技有限公司)；Cr測定試劑盒(上海復星長征醫學科學有限公司)；BUN檢測試劑盒(寧波美康生物科技股份有限公司)。

1.4 實驗方法及分組 本實驗主要建立SD大鼠擠壓傷-CS動物模型。將SD大鼠48只隨機(隨機數字法)分為實驗組(40例)和對照組(8例)。以俯臥位將實驗組大鼠放置于固定臺U形固定架內，待壓雙下肢后伸平放，以細繩寬松栓住雙足后將雙后肢拉伸置于固定臺后方中間的條形槽內，鼠尾置于最中心的條形槽；將承重板插入金屬柱螺桿后，配加10 kg重[9]金屬砝碼(圖1)。實驗過程中大鼠不給予進食、飲水，不作麻醉，身體前部和雙前肢可自由活動。預定擠壓時間到達后解除壓迫。對照組大鼠不作處理，作為正常對照。

圖1 大鼠擠壓傷模型

1.5 測定指標和方法

1.5.1 大體觀察 觀察實驗組大鼠存活情況，于擠壓4、6、12、24、48 h 各取8只大鼠，觀察大鼠雙下肢活動情況，并通過排泄孔觀察血尿發生情況。

1.5.2 血生化檢測 大體觀察后，各時間點實驗組大鼠于解除壓迫后4 h在不作麻醉下直接用長頸(3～4 cm)硬質玻璃滴管(毛細管內徑0.5～1.0 mm)在大鼠眼內眥處旋轉插進，通過眼眶靜脈叢采血約2～3 ml，以2000 r/min離心機離心20 min，吸出上層血清，檢測反映肝功能的AST和ALT，反映腎功能的BUN、Cr、K+以及反映心肌損傷的CK。對照組同法采血檢測。

2 結 果

2.1 大體觀察 實驗組共40只大鼠，擠壓期間共7只大鼠死亡，其中擠壓后12 h死亡1只，擠壓24 h死亡2只，擠壓48 h死亡4只。解除壓迫后，存活大鼠雙下肢腫脹明顯，不能正常活動。解剖肌肉組織可見肌肉水腫，顏色變蒼白，隨著擠壓時間推移肌肉顏色逐漸呈暗紅色，并有淡紅色液體滲出。實驗組擠壓4 h大鼠無血尿發生，6、12、24、48 h分別有2只(25.0%)、3只(37.5%)、3只(37.5%)、5只(62.5%)發生血尿(含死亡大鼠)。

2.2 血生化指標檢測結果 實驗組在4、6、24、48 h 各時間點亞組的ALT、AST均顯著高于對照組(均P>0.05)；在4、24、48 h各亞組的BUN，以及24、48 h亞組的CK均顯著高于對照組(均P<0.05)；Cr、K+組間比較差異無統計學意義(均P>0.05)。不同時間點之間比較的結果見表1。

指標對照組實驗組4h6h12h24h48hFPALT(U/L)43．65±10．13168．33±20．14②149．75±22．50②111．27±46．06229．97±135．93①271．23±89．76①5．5750．004AST(U/L)101．25±13．18750．23±175．26①765．22±119．25①597．17±334．41②1046．20±560．73①1143．95±264．60①6．7480．002BUN(mg/dl)7．03±1．6524．20±9．98②18．31±3．9414．57±3．5431．73±18．54①25．79±4．49①3．9380．018Cr(μmol/L)33．60±6．2644．70±15．1036．20±4．7531．80±3．8372．80±43．4936．78±5．162．4500．082K+(mmol/L)6．02±0．776．39±0．685．77±0．416．26±0．776．11±0．395．94±0．980．3410．880CK(U/L)624．13±246．516515．97±389．17①5822．5±3394．09①1024．47±1054．094256．97±2917．503351．55±1486．243．8420．019

注：不同擠壓時間與對照組的檢測指標對比，①P<0.01；②P<0.05

3 討 論

本課題大鼠擠壓傷動物模型，主要以10 kg擠壓重量，分別擠壓4、6、12、24、48 h 5個時間節點后解壓，并在解除壓迫后分別觀察SD 大鼠生理、生化變化，選擇指標為常見的AST、ALT、CK、BUN等，結果發現指標均明顯升高，擠壓部位的肌肉組織有的缺血損傷，符合擠壓傷動物模型特點。實驗的結果顯示，擠壓4、12 h組的血鉀高于對照組，同時還高于擠壓24 h和48 h組，說明血K+升高不宜作為診斷擠壓傷的指標，它可能只是擠壓傷后急性死亡的原因之一。

擠壓傷多見于四肢，以雙下肢為代表的橫紋肌肌肉組織分布較豐富，因此本實驗以10 kg重物擠壓雙下肢制作擠壓傷模型。目前文獻報道的擠壓傷數據大多來自地震導致的傷員，其中又以4～6 h擠壓解除時間為主[10]，因此，考慮到大鼠與人類的差異及實驗數據模擬的相似度，本實驗設定解除壓迫后4 h作為實驗觀察點。與其他研究擠壓傷動物實驗研究不同[11]，本實驗在擠壓大鼠時不給予進食、飲水，目標是模擬踩踏事件的現場實際情況。

實驗組大鼠在各時間點解壓后，其受壓的雙下肢均出現了明顯腫脹，但此時測量腫脹周徑各組間并無顯著性差異(P>0.05)，說明不同擠壓時間造成大鼠肢體的損傷，但壓迫時間是否對擠壓傷進程的速度有影響，尚需進一步觀察和實驗。隨著擠壓時間的延長，ALT、AST檢測指標逐漸升高，說明肝臟發生氧化應激過程中降解肌肉分解產物的負擔逐步加重，導致肝臟功能損傷。實驗組的血生化檢測結果也顯示，隨著擠壓時間延長而較對照組有不同程度增加，實驗組中不同擠壓時間組的ALT、AST、K+、BUN、Cr、CK 等指標均較對照組有明顯升高，但每項指標并沒有體現出擠壓時間越長，指標改變越明顯的特點。反映心臟損傷的CK高峰值出現在擠壓4 h組，反映腎臟損傷的K+、BUN 和 Cr 分別于擠壓4、24 和 24 h 達高峰，反映肝臟損傷的ALT和AST高峰都出現在擠壓48 h組，說明隨著擠壓時間延長，肌肉分解產物的毒性對心臟、腎臟、肝臟的損傷作用具有序貫性和時間依賴性，可能與擠壓傷的發展進程有關。而在擠壓48 h組中Cr、K+、CK等檢測指標均有大幅降低，是否具有特殊意義或與采血過程中負壓產生溶血有關，尚需要進一步深入研究。

在本實驗中，擠壓12 h的平均測量值均較6 h的值降低(除K+)，但24 h時平均測量值又升高且大于6 h，筆者查閱相關文獻尚未發現類似報道，因此考慮存在以下可能性。一是本實驗設定解除壓迫后4 h作為實驗觀察點，與文獻[11]采用解除壓迫后3 h作為實驗觀察點不同，這可能是本文與其部分生化指標有差異的原因；二是與大鼠在擠壓12 h后的機體應激狀態有關，是否與經歷了一定時間的擠壓后機體自我修復能力適應性增強有關；三是同大鼠的選擇有關，雖然選擇了同一批次，體重上無差異的大鼠進行隨機分配，但難以避免大鼠的生理機能出現不同程度的差異，造成實驗中數據差異。以上均為推測，尚有待以后的實驗中尋找明確的答案。

綜上所述，受單一重量(10 kg)擠壓的SD大鼠擠壓時間4 h及以上，均出現雙下肢明顯腫脹，受壓肌肉壞死，BUN、Cr、ALT、AST、K+、CK 等血生化指標升高，說明生化發生不同程度改變。據此，由于現場傷員隨時會發生變化，只要傷員未得到最終的醫療救治，就必須不斷對傷員進行檢傷分類[12]。有專家研究認為，踩踏事故中，主要有撞擊、擠壓和碾挫等致傷方式[8]，由于本實驗模型設計為單一致傷因素，所以在今后的研究中應該增加撞擊、碾挫等復合致傷因子，以使實驗模型更加貼近災害現場擠壓傷的綜合情況，以便為臨床救治提供更全面的科學依據。

志謝：感謝江蘇大學醫學院楊慧建和萬曉蕾碩士對實驗研究所做的工作和相關幫助。

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(2015-01-12收稿 2015-02-01修回)

(責任編輯 郭 曉)

Biochemical observation in the different time of lower limbs crush injury in rats model

ZOUShengqiang1，2,PANXin1,WEIChao1,SUZhaoliang1,andWANGYitang3.

1.DepartmentofDisasterandEmergencyMedicine,ClinicalMedicalCollege,JiangsuUniversity,Zhenjiang212005,China；2.ZhenjiangThirdHospitalAffiliatedtoJiangsuUniversity,Zhenjiang212005,China; 3.DepartmentofEmergency,NanjingUniversity,Nanjing210029,ChinaCorrespondingauthor:PANXin,E-mail:jjzxywk@126.com

Objective To explore the biochemical changes of rats crushed with different time. Methods A total of 48 Sprague Dawley rats (2-month-old, male or female, weighing 160～200 g) were randomly divided into the control group (n=8) and experimental group (n=40). The experimental group was divided into 5 groups according to the crushing time, e.g. 4 h, 6 h, 12 h, 24 h, 48 h, with 8 rats in each group. The changes in the both lower limbs of rats were observed 4 hours after every treatment time, meanwhile, orbital blood of rats were collected for blood biochemical detection. Results 7 rats died during compressing, and obvious swelling were observed after removing loads among lower limbs of all survivals, as well as activity limitation. Compared with control group, the serum level of alanine aminotransferase (ALT), aspartate aminotransferase (AST), urea nitrogen (BUN), creatine kinase (CK) in experimental groups were significantly higher than those in control group, all with a statistically significant difference (P<0.05), whereas the serum level of creatinine (Cr), K+showed no significant difference between experimental and control group (P>0.05). Conclusions Different crushing time has different effect on biochemical index of rats.

crush injury; reperfusion; rats model

10.13919/j.issn.2095-6274.2015.02.004

江蘇省鎮江市社會發展科技支撐項目(SH2013097)

鄒圣強，碩士，教授，E-mail:1210xyz@163.com

1.212005 鎮江,江蘇大學醫學院災難與急救醫學系； 2.212005，江蘇大學附屬鎮江三院 3. 210029，南京醫科大學急診醫學系

潘 鑫，E-mail:jjzxywk@126.com

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