靈芝酸發(fā)酵條件優(yōu)化

祝鐵鋼，孫金旭，朱會(huì)霞，葛曉楠，何新航，張宇豪

（河北衡水學(xué)院生命科學(xué)系，河北衡水053000）

靈芝是一種具有良好藥性的真菌，自古以來(lái)一直被作為中藥所使用，原因就在于靈芝在免疫力、護(hù)肝、降低血糖膽固醇、腫瘤防治等方面有明顯的改良作用，免疫力方面，靈芝可以提高機(jī)體免疫力，增強(qiáng)機(jī)體的抵抗能力；保肝護(hù)肝方面，可以保護(hù)肝臟維持其正常解毒功能；血糖膽固醇方面，可以降低血糖和膽固醇防治糖尿病與脂肪肝等疾病；另外，靈芝在抗腫瘤方面也具有一定的功效[1-2]。1982年Kubota[3]首次從靈芝當(dāng)中分離得到靈芝酸，但是國(guó)內(nèi)靈芝酸的研究起步較晚，國(guó)內(nèi)首次相關(guān)報(bào)道起始于陳國(guó)良[4]關(guān)于靈芝酸研究進(jìn)展的綜述。雖然，靈芝酸有良好的藥用價(jià)值，但靈芝酸的產(chǎn)量較低。20世紀(jì)80年代，開(kāi)始注重靈芝深層發(fā)酵代謝產(chǎn)物的生產(chǎn)以及其組成成分的研究[5]。

近年來(lái)關(guān)于靈芝酸的研究主要集中在分離純化、化學(xué)結(jié)構(gòu)和活性等方面[6]，但關(guān)于通過(guò)靈芝酸發(fā)酵條件優(yōu)化來(lái)提高產(chǎn)量的研究較少，因此就靈芝酸發(fā)酵條件中的葡萄糖、酵母膏、VB1、溫度、轉(zhuǎn)速、裝液量、誤差進(jìn)行了深入研究以提高靈芝酸的產(chǎn)量。

1 材料和方法

1.1 材料和試劑

靈芝，由衡水學(xué)院生物系微生物實(shí)驗(yàn)室提供。

95%乙醇，氯仿，NaHCO3，鹽酸，乙酸，乙腈。

1.2 儀器

Agilent1100高效液相色譜：美國(guó)安捷倫有限公司；EV311旋蒸儀：萊伯泰科有限公司；JA1203電子天平：上海田宮稱重制造有限公司。

1.3 樣品等處理方法

1.3.1 靈芝酸標(biāo)準(zhǔn)液處理

準(zhǔn)確秤取靈芝酸標(biāo)準(zhǔn)品10 mg，放入容積為100mL的容量瓶中，乙醇稀釋至刻度，配置成濃度為1 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液，4℃冷藏備用。

1.3.2 靈芝酸的提取處理

適量秤取靈芝子實(shí)體，95%乙醇進(jìn)行超聲輔助提取，料液比例為 1∶20（mg/mL）；提取溫度，70℃；浸提時(shí)間12 h，浸提后過(guò)濾，取濾液，真空薄膜旋蒸處理，真空濃縮至干，得到提取物浸膏，該浸膏用氯仿溶解，反復(fù)用水萃取5次，取氯仿層，過(guò)濾，取濾液，用飽和NaHCO3溶液萃取3次，取NaHCO3萃取層，3次用鹽酸調(diào)節(jié)至溶液pH為2～3之間，取沉淀物，沉淀物用氯仿溶解，真空薄膜旋蒸處理，濃縮至干，得到粗靈芝酸。

1.4 HPLC測(cè)定條件[7]

HPLC法測(cè)定靈芝中靈芝酸產(chǎn)量條件為：色譜柱Agilent Hpersil（5 μm 4.6×250 mm）；流動(dòng)相為 2%乙酸：2%乙腈（體積比為 7∶3）；流速 0.3 mL/min；進(jìn)樣量10 μL外標(biāo)法定量；柱溫30℃；檢測(cè)波長(zhǎng)254 nm。

1.5 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

選用葡萄糖、酵母膏、VB1、溫度、轉(zhuǎn)速、裝液量和誤差作為影響因素，各取3個(gè)水平，進(jìn)行L18（37）正交試驗(yàn)，見(jiàn)表1。

表1 培養(yǎng)基優(yōu)化正交試驗(yàn)因素水平表Table 1 Factors and levels of orthogonal test for medium optimization

2 結(jié)果與討論

靈芝在免疫力、護(hù)肝、降低血糖膽固醇、腫瘤防治等方面有明顯的改良作用，因此，關(guān)于提高靈芝酸產(chǎn)量的研究也逐漸成為了科研熱點(diǎn)之一，由于不同的發(fā)酵條件對(duì)靈芝酸產(chǎn)量有較大的影響，因此可以通過(guò)正交試驗(yàn)優(yōu)化試驗(yàn)條件可以得出最佳因素組合，試驗(yàn)安排見(jiàn)表1，試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2，方差分析見(jiàn)表3。

表2 靈芝酸發(fā)酵條件正交試驗(yàn)結(jié)果表Table 2 Results of orthogonal test for fermentation conditions optimization

表3 靈芝酸發(fā)酵條件正交試驗(yàn)方差分析表Table 3 Variance analysis of orthogonal test for fermentation conditions optimization

由表2和表3可以得出培養(yǎng)基成分當(dāng)中酵母膏差異顯著、培養(yǎng)條件當(dāng)中溫度差異顯著，說(shuō)明酵母膏和溫度兩個(gè)因素對(duì)靈芝酸的產(chǎn)量影響顯著；其中7個(gè)因素當(dāng)中影響程度從大到小依次為酵母膏、溫度、轉(zhuǎn)速、葡萄糖、裝液量、VB1和誤差。對(duì)于3個(gè)不同水平比較而言，分別在 A2、B3、C3、D1、E2、F2、G2下靈芝酸產(chǎn)量最高。所以最佳試驗(yàn)方案為葡萄糖20 g/L，酵母膏1.5 g/L，VB10.02 mg/L，溫度為 26℃，轉(zhuǎn)速 150 r/min，裝液量100mL/500mL。與金德寬[8]發(fā)表的靈芝酸工藝發(fā)酵條件的優(yōu)化結(jié)果對(duì)比可以得出，轉(zhuǎn)速均為150 r/min，裝液量均為100 mL，試驗(yàn)結(jié)果一致，但在金德寬試驗(yàn)結(jié)果中溫度為30℃，本試驗(yàn)結(jié)果溫度為26℃，存在一定差異，但差異不顯著；在A2B3C3D1E2F2G2下最高產(chǎn)量為1.68 g/L，未優(yōu)化前靈芝酸產(chǎn)量為1.26 g/L，經(jīng)過(guò)優(yōu)化后產(chǎn)量增加0.42 g/L。另外在各試驗(yàn)組合中可以看出，各試驗(yàn)結(jié)果靈芝酸產(chǎn)量從大到小依次6＞12＞14＞18＞15＞ 3＞2＞ 11＞9 ＞4＞16＞17＞13＞ 7＞10 ＞1＞8＞5。

3 結(jié)論

以酵母膏、溫度、轉(zhuǎn)速、葡萄糖、裝液量、VB1和誤差為7個(gè)影響因素，以靈芝酸為目的產(chǎn)物設(shè)計(jì)了L18（37）正交試驗(yàn)，并進(jìn)行相關(guān)的方差分析結(jié)果得出靈芝酸的適宜條件為：葡萄糖20g/L，酵母膏1.5g/L，VB10.02mg/L，溫度為26℃，轉(zhuǎn)速150 r/min，裝液量100 mL/500 mL。

[1] 蔣婷婷.靈芝三萜類成分的研究進(jìn)展[J].海峽藥學(xué),2012(1):1-2

[2] 楊錦生.靈芝主要化學(xué)成分及其藥理作用研究述評(píng)[J].中華中醫(yī)藥學(xué)刊,2012(4):1-3

[3] Kubora T,Asaka Y,Miura I,et al.Structures of Ganoderic A and B,two new 1anostane type bitter triterpenes from Ganoderma lucidum(Fr)Karst[J].Helv Chim Acta,1982,65(2):611-619

[4] 陳國(guó)良,陳曉清.靈芝有效成分研究綜述[J].中國(guó)食用菌,1995,14(4):7-9

[5] 李民,陳長(zhǎng)慶.重組大腸桿菌高密度發(fā)酵研究進(jìn)展[J].生物工程進(jìn)展,2000,20(2):26-30

[6] 林志彬.靈芝現(xiàn)代研究[M].北京:北京醫(yī)科大學(xué)出版社,2001:21-25

[7] 鄢嫣,聶少平,陳奕.靈芝氯仿提取物的HPLC指紋圖譜的研究[J].食品與生物技術(shù)學(xué)報(bào),2009,28(5):589-593

[8] 金德寬.靈芝酸發(fā)酵工藝條件的優(yōu)化[J].中國(guó)釀造,2011(9):1-6