響應(yīng)面法優(yōu)化野生紅心果果酒發(fā)酵工藝條件

李敏杰，熊亞，韓洪波

（1.攀枝花學(xué)院生物與化學(xué)工程學(xué)院，四川攀枝花617000；2.攀枝花市干熱河谷特色生物資源工程技術(shù)中心，四川攀枝花617000）

紅心果，又名番石榴、芭樂、雞屎果。成熟時(shí)淡黃或粉紅色，因其果肉呈紅色而得名，肉質(zhì)鮮嫩、綿軟香甜，味略酸，氣味濃烈，有助消化。紅心果是一種適應(yīng)性很強(qiáng)的熱帶野生果樹，在攀枝花山區(qū)分布較廣，果實(shí)富含維生素，特別是VC，含有大量的氨基酸及微量元素如鐵、鉀、胡蘿卜素等[1]，其根、莖、葉均可作藥用，已有關(guān)于從紅心果葉提取多糖、多酚[2-3]，討論其藥理作用的研究報(bào)道[4]，因此紅心果果樹全身都是寶，具有潛在的市場開發(fā)價(jià)值。近年來，對紅心果的研究越來越多，主要集中在其果實(shí)的加工方面，如紅心果茶酒[5]、醋飲料[6]、果脯[7]、果條[8]、果凍[9]、復(fù)合飲料[10-11]等方面，楊勝遠(yuǎn)等[12]利用正交試驗(yàn)探討了紅心果果酒的釀制條件，得到了釀造過程中酒曲添加量、溫度、初始pH及加糖量的最佳參數(shù)，李敏杰等[13]利用正交設(shè)計(jì)，從發(fā)酵溫度、SO2添加量及酵母菌添加量3個(gè)方面探討了紅心果果酒發(fā)酵的最佳條件。利用響應(yīng)面進(jìn)行紅心果果酒發(fā)酵工藝優(yōu)化的研究少見有報(bào)道。響應(yīng)面分析法[14]作為實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及統(tǒng)計(jì)的一種基本方法，在生物學(xué)中應(yīng)用相當(dāng)廣泛，是生物學(xué)中的一種重要優(yōu)化方法，主要用于確定各種工藝或培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)的最優(yōu)條件。

本試驗(yàn)以紅心果果酒發(fā)酵過程中的酒精度為響應(yīng)值，采用單因素試驗(yàn)和響應(yīng)面分析法對紅心果果酒的發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，為今后進(jìn)行紅心果果酒工廠化生產(chǎn)提供一定的參考。

1 材料及方法

1.1 材料與儀器

野生紅心果：采自四川省攀枝花市仁和區(qū)大田鄉(xiāng)；酵母（安琪高活性酵母）：湖北宜昌安琪酵母股份有限公司；亞硫酸（99.8%）：成都科龍化工試劑廠。

10609CHO手持折光儀：鄭州南北儀器設(shè)備公司；BL610電子天平：上海靜天電子儀器有限公司；BM255果汁機(jī)：美的集團(tuán)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 試驗(yàn)流程

[13]中的試驗(yàn)流程。

1.2.2 單因素試驗(yàn)

在本試驗(yàn)中，選用發(fā)酵溫度、SO2添加量及酵母菌接種量3個(gè)因素，按照發(fā)酵溫度分別為20、22、24、26、28℃，二氧化硫添加量分別為40、50、60、70、80、90mg/kg，接種體積分?jǐn)?shù)分別為3%、4%、5%、6%、7%的酵母菌進(jìn)行紅心果果酒發(fā)酵，發(fā)酵完畢測定酒精度。

1.2.3 響應(yīng)面試驗(yàn)

選定二氧化硫添加量（X1）、酵母接種量（X2）和發(fā)酵溫度（X3）為自變量，酒精度（Y）為響應(yīng)值，利用軟件SAS 9.2進(jìn)行響應(yīng)面分析，確定所選各因素對果酒發(fā)酵酒精度的影響，得到最優(yōu)參數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)

2.1.1 二氧化硫添加量對紅心果果酒酒精度的影響

圖1表明二氧化硫添加量對酒精度的影響。

圖1 二氧化硫添加量對酒精度的影響Fig.1 Effect of SO2amount on alcoholic strength

在SO2添加量從40 mg/kg增加到70 mg/kg時(shí)，酒精度值也隨著增加，在添加量為70 mg/kg時(shí)，酒精度值達(dá)到最大，為9.2%。當(dāng)二氧化硫添加量繼續(xù)增加時(shí)，酒精度值不再升高，反而有所下降，二氧化硫添加量過高，可在一定程度上抑制酵母菌的發(fā)酵活性，勢必會(huì)影響到果酒發(fā)酵的酒精度。故二氧化硫添加量控制在70 mg/kg較為合適。

2.1.2 酵母菌接種量對紅心果果酒酒精度的影響

圖2表明接種量對酒精度的影響。

圖2 酵母菌接種量對酒精度的影響Fig.2 Effect of inoculation amount of yeast on alcoholic strength

圖2表明，在酵母菌接種量從4%到6%時(shí)，酒精度一直呈上升趨勢，由此可見，接種量在6%時(shí)，酒精度達(dá)到最大值，為9.5%。隨著接種量的繼續(xù)增加，酒精度反而開始下降，這可能是因?yàn)榻湍妇臃N量過大，其生長代謝衰亡期提前，對發(fā)酵造成影響。因此，選擇6%的酵母菌接種量比較合適。

2.1.3 發(fā)酵溫度對紅心果果酒酒精度的影響

圖3表明發(fā)酵溫度對酒精度的影響。

圖3 發(fā)酵溫度對酒精度的影響Fig.3 Effect of fermentation temperature on alcoholic strength

圖3表明，發(fā)酵溫度從22℃到26℃，酒精度不斷上升，在26℃的時(shí)候達(dá)到最大值。溫度的高低，會(huì)影響酵母菌的生長，其發(fā)酵活性也會(huì)受到影響。因此，我們將溫度控制在26℃。

2.2 響應(yīng)面分析

2.2.1 選取響應(yīng)面分析的因素及水平

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，進(jìn)行三因素三水平的響應(yīng)面試驗(yàn)分析。表1表明響應(yīng)面分析因素與水平的選取值。

表1 響應(yīng)面分析因素與水平Table 1 Analytical factors and levels for RSA

2.2.2 響應(yīng)面試驗(yàn)方案及結(jié)果

表2表明響應(yīng)面試驗(yàn)方案及試驗(yàn)結(jié)果。

表3表明響應(yīng)面分析的結(jié)果。

對三個(gè)因素作如下變換：X1=（A-70）/10，X2=（B-6）/1，X3=（C-24）/2。以此三個(gè)因素作為自變量，酒精度（Y）為響應(yīng)值，采用SAS 9.2軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析（表2）。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)方案及試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Program and results of RSA

表3 回歸分析結(jié)果Table 3 Results of regression analysis

經(jīng)回歸擬合，建立數(shù)學(xué)模型：

Y=8.5+0.037 5X1+0.087 5X2+0.225X3-0.125X1X1-0.075X1X3-0.125X2X2-0.025X2X3-0.2X3X3。式中：Y為酒精度，%；X1為 SO2添加量，mg/kg；X2為酵母菌接種量，%；X3為發(fā)酵溫度，℃。

根據(jù)數(shù)學(xué)模型，對 X1、X2、X3求偏導(dǎo)，帶入各因素的變換方程中求得SO2添加量即A=51.3 mg/kg，酵母菌接種量即B=5.33%，發(fā)酵溫度即C=24.98℃。在此優(yōu)化條件下，紅心果果酒發(fā)酵酒精度的理論值為9.58%。

表3表明，模型達(dá)到顯著水平，說明試驗(yàn)設(shè)計(jì)可靠，擬合的二次回歸方程合適，據(jù)此可以看出，該回歸模型可用來預(yù)測響應(yīng)值酒精度（Y）的具體情況。由回歸方程中的各項(xiàng)系數(shù)所具有的顯著性可知，因素X2對酒精度（Y）具有顯著的影響效應(yīng)，因素X3對酒精度（Y）具有極顯著的影響，且均為正效應(yīng)；而因素X1對酒精度（Y）不具有顯著的影響；二次項(xiàng)因素中X3X3對酒精度（Y）具有極顯著的影響，而X1X1、X2X2對酒精度（Y）具有顯著影響；交互式因素 X1X2、X1X3、X2X3對酒精度（Y）不具有顯著影響，因此各具體試驗(yàn)因素對響應(yīng)值的影響不是簡單的線性關(guān)系。

2.2.3 紅心果果酒發(fā)酵工藝的響應(yīng)面及等高線圖

通過響應(yīng)面圖形可以直觀的觀察到試驗(yàn)設(shè)計(jì)的最優(yōu)組合，對最佳參數(shù)及各參數(shù)之間的相互作用也一目了然[15]，響應(yīng)值會(huì)受到各因素或其交互作用的影響，其影響效果可以通過等高圖來體現(xiàn)[16]。響應(yīng)面分析及等高線圖見圖4～圖6。

圖4表明SO2添加量及酵母菌接種量對酒精度的響應(yīng)面及等高線圖。

圖4 SO2添加量及酵母菌接種量對酒精度的響應(yīng)面及等高線圖Fig.4 Responsive surfaces and counter of SO2amount and yeast inoculation amount.

圖5表明SO2添加量及發(fā)酵溫度對酒精度的響應(yīng)面及等高線圖。

圖6表明發(fā)酵溫度及酵母菌添加量對酒精度的響應(yīng)面及等高線圖。

2.2.4 驗(yàn)證試驗(yàn)

為驗(yàn)證響應(yīng)面法所得結(jié)果的可靠性，在上述響應(yīng)面分析法求得的最佳條件下重復(fù)發(fā)酵3次，實(shí)際測的的平均酒精度為9.61%，與模型預(yù)測值9.58%基本一致，可見模型能較好地預(yù)測實(shí)際發(fā)酵酒精度的情況，適合于此發(fā)酵工藝，因此，基于響應(yīng)面優(yōu)化的發(fā)酵工藝參數(shù)可靠，具有實(shí)用價(jià)值。

圖5 SO2添加量及發(fā)酵溫度對酒精度的響應(yīng)面及等高線圖Fig.5 Responsive surfaces and counter of SO2amount and fermentation temperature

圖6 發(fā)酵溫度及酵母菌添加量對酒精度的響應(yīng)面及等高線圖Fig.6 Responsive surfaces and counter of fermentation temperature and inoculation amount of yeast

3 結(jié)論

通過單因素試驗(yàn)，二氧化硫添加量控制在70 mg/kg比較好，酵母菌接種量控制在6%比較好，發(fā)酵溫度則控制在26℃較好，酒精度值最高。在此基礎(chǔ)上再利用響應(yīng)面分析法對紅心果果酒發(fā)酵的工藝條件進(jìn)行了研究，考察了二氧化硫添加量、酵母菌接種量和發(fā)酵溫度3個(gè)因素對酒精度的影響，得到最佳參數(shù)為二氧化硫添加量A為51.3mg/kg，酵母菌接種量B為5.33%，發(fā)酵溫度C為24.98℃。在此發(fā)酵工藝條件下野生紅心果果酒酒精度的理論值為9.58%。通過驗(yàn)證試驗(yàn)，在此優(yōu)化條件下的實(shí)際平均酒精度為9.61%。由此可見，通過響應(yīng)面法得到的紅心果果酒發(fā)酵條件參數(shù)準(zhǔn)確可靠，實(shí)際工藝可以以此作為借鑒。果酒發(fā)酵工藝是一種成熟的工藝，響應(yīng)面法目前來說可以很好地用于發(fā)酵工藝最佳參數(shù)的確定，但它不是唯一方法，在今后的類似分析中，應(yīng)該盡可能的使用多種統(tǒng)計(jì)方法對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析處理，才能使最終的結(jié)果更為準(zhǔn)確和可靠。

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