均勻設計法優選仙茅多糖提取工藝的研究

杜永華，蒲忠慧，魏琴，尹禮國，張萍，徐莉，張琪

（1.宜賓學院發酵資源與應用四川省高校重點實驗室，四川宜賓644007；2.綿陽師范學院生命科學與技術學院，四川綿陽621006；3.宜賓學院生命科學與食品工程學院，四川宜賓644007）

多糖（polysaceharide）是一類天然大分子化合物，存在于動植物和微生物中，為生命物質的組成成分之一。大量藥理及臨床研究證實，多糖有提高機體的免疫力、抗病毒、抗腫瘤、抗衰老、抗輻射、降血糖和降血脂等生理功能[1-9]。因此，對多糖的研究已成為各國學者關注的焦點。

仙茅（Curculigo orchioides Gaertn）是石蒜科仙茅屬植物仙茅的干燥根莖，具有抗缺氧、抗高溫、鎮靜、抗驚厥、抗炎、抗骨質疏松、增強免疫功能、抗衰老[10]、促進乳腺發育[11]、延緩生殖系統老化和雄激素樣[12]作用等功效，其中多糖類化合物是仙茅根中重要的藥效成分。周勇等[13]研究表明仙茅多糖具有免疫調節和抗腫瘤等作用。有關仙茅多糖提取工藝的報道極少，聶詩明等[14]采用正交試驗以仙茅苷和仙茅多糖為評價指標優選仙茅水煎煮工藝。本研究擬采用均勻設計法對仙茅多糖的提取工藝和含量測定進行研究，以期為仙茅進一步開發提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

仙茅根：產地為四川，購自于四川宜賓正源藥業有限公司，由其鑒定為石蒜科植物仙茅（Curculigo orchioides Gaertn）的干燥根莖。

所有試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

中草藥粉碎機：天津市泰斯特儀器有限公司；旋轉蒸發儀R502B：上海亞榮生化儀器廠；紫外可見分光光度計：北京譜析通用儀器有限公司；TCL-16C型高速離心機：上海安亭科學儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 仙茅粗多糖的提取

參考季春[15]的方法提取仙茅粗多糖。將市購仙茅粉碎，篩選出80目～100目的細粉于50℃烘箱內烘干，取50 g，按比例加入蒸餾水回流提取，過濾，濃縮至約100 mL，再將濃縮液用Savage法除蛋白，即是向濃縮液中加其1/4體積的三氯甲烷，隨之再加入三氯甲烷體積1/4的正丁醇，劇烈振搖5 min～10 min，混勻，以1 500 r/min離心20 min，分去水層與有機層交界處的變性蛋白質，水層仍按照此方法反復除蛋白5次：然后在上清液中加入95%乙醇調含醇量為80%，沉淀過夜。沉淀用布氏漏斗抽濾，然后用無水乙醇和丙酮反復多次抽洗，直至沉淀呈粉末狀時將其置于表面皿中。將表面皿于60℃干燥至恒重即得仙茅多糖粗品，計算粗多糖得率。

1.3.2 提取工藝優化

采用均勻設計試驗，選取對提取率影響較大的因素：提取溫度（χ1）、液固比（χ2）、浸泡時間（χ3）、提取時間（χ4），進行U10（104），即四因素十水平均勻設計優選提取仙茅多糖（見表1），每個因素10水平，以仙茅多糖得率為指標確定最佳提取工藝。試驗安排方法見表2。

表1 仙茅提取工藝均勻設計因素水平表Table 1 Factors and levels of uniform design experiments for optimizing extraction processing of Curculigo orchioides Gaertn

續表1 仙茅提取工藝均勻設計因素水平表Continue table 1 Factors and levels of uniform design experiments for optimizing extraction processing of Curculigo orchioides Gaertn

表2 仙茅提取工藝均勻設計試驗方案Table 2 Pilot programs of uniform design experiments for optimizing extraction processing of Curculigo orchioides Gaertn

1.3.3 含量測定

采用苯酚-硫酸比色法測定粗多糖中仙茅總糖含量。按照以下公式計算仙茅多糖含量：總多糖提取率/%=（粗多糖提取物總重量×粗多糖中總糖含量）/仙茅質量×100

粗多糖得率/%=粗多糖凈重/仙茅質量×100

1.3.4 驗證試驗

按照仙茅苷提取的優化條件進行驗證試驗。

1.3.5 數據統計

采用Uniform Design Version3.00對試驗結果進行后退回歸分析，根據回歸方程的回歸系數、F值及其顯著性檢驗，由軟件采用單指標Ⅰ型可約束條件試驗優化方案選取優化工藝。

2 結果與分析

2.1 葡萄糖標準曲線的繪制

葡萄糖標準曲線回歸方程如下：y=0.007 6x+0.025 6，決定系數 R2=0.996 8，

式中：y為吸光度，x葡萄糖標準曲線中對應的葡萄糖質量濃度（μg/mL）。

2.2 均勻設計試驗結果

采用均勻設計試驗安排的仙茅浸膏的提取結果及仙茅苷提取率結果見表3。

表3 仙茅粗多糖的得率及總多糖的含量Table 3 Yield and total polysaccharide content of Curculigo orchioides Gaertn polysaccharides

由表3可知，在仙茅粗多糖凈重和得率方面：7號試驗組最少，分別為8.49 g和16.98%；9號試驗組最多，分別為10.64 g和21.28%。9號試驗組的提取條件為提取溫度95℃，液固比30倍，浸泡時間30 min，提取時間30 min。

根據標準曲線回歸方程計算出各試驗樣品中仙茅總糖含量表示：在仙茅總多糖質量和多糖提取率方面：2號試驗組最低，分別為1.28 g和2.56%；8號試驗組最高，分別為2.98 g和5.97%。8號試驗組的提取條件為提取溫度90℃，液固比15倍，浸泡時間135 min，提取時間150 min。

2.3 均勻設計試驗統計分析

采用Uniform Design Version 3.00對試驗結果進行后退回歸分析，在顯著水平α=0.10時，第一次回歸方程為Y=2.927 9+0.042 0X1-0.040 2X2+0.000 9X3-0.006 1X4，復相關系數 R=0.924 4，F檢驗值（7.342）＞F臨界值（3.520），回歸方程顯著。各方程對回歸的貢獻值（偏回歸平方和）U1（2.843）＞U2（2.613 7）＞U4（0.963 0）＞U3（0.012 6）。將第三方程項X3進行顯著性檢驗，F檢驗值（0.0523）＜F臨界值（4.060），方程不顯著，剔除方程項X3。新建回歸方程為Y=2.932 1+0.042 9X1-0.041 2X2-0.006 0X4，復相關系數 R=0.923 6，F檢驗值（11.60）＞F臨界值（3.289），方程顯著。再次對貢獻最小的方程項X4進行顯著性檢驗，α=0.10，F檢驗值（4.717）＞F臨界值（3.776），方程顯著，不需再剔除方程項。新建回歸方程的顯著性檢驗變量分析和殘差分析見表4和表5。

表4 變量分析Table 4 Variance analysis

表5 回歸模型殘差分析Table 5 Residual analysis of regression equation

根據新建回歸方程，采用網格嘗試法單指標Ⅰ型可約束條件試驗優化方案，優化試驗條件，得到仙茅粗多糖的最佳提取工藝：提取溫度為100℃，液固比為10 ∶1（mL/g），提取時間為 30 min。在此條件下，仙茅總多糖的預期得率為（6.63±0.87）%。

2.4 均勻驗證

稱取80目～100目的上述仙茅粉50 g，于50℃烘箱內烘干，以提取溫度100℃，液固比10∶1（mL/g），提取時間30 min為提取工藝，用水回流提取，過濾，濾液60℃減壓濃縮，濃縮液（約100 mL）用95%乙醇調含醇量為80%，靜置過夜，過濾取沉淀，沉淀用無水乙醇洗滌，常溫真空干燥，采用蒽酮-硫酸法測定仙茅多糖的含量。結果：粗多糖得率為21%，總多糖提取率為6.18%。

3 結論

通過對均勻設計法優化仙茅粗多糖提取工藝的研究，結果表明提取溫度、液固比、提取時間對仙茅總多糖得率影響顯著，而浸泡時間對仙茅總多糖得率影響很小。經過均勻設計試驗回歸統計分析優選仙茅粗多糖的最佳提取工藝為：提取溫度為100℃，液固比為10 ∶1（mL/g），提取時間為 30 min，仙茅總多糖得率為6.18%。

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