超聲波改性與MTGase誘導的大豆分離蛋白凝膠強度的研究

田海娟，王蕾，張智宇

（1.吉林工商學院食品工程分院，吉林長春130062；2.吉林工商學院糧油食品深加工吉林省高校重點實驗室，吉林長春130062；3.山東省食品藥品檢驗研究院，山東濟南250101）

大豆分離蛋白（Soy Protein Isolated，SPI）是大豆蛋白質含量在90%以上的粉狀蛋白大豆產品[1]。在大豆蛋白的4個組分中，具有膠凝能力的只有7s和11s成分，又在硬度和組織性方面，11s組分膠凝性高于7s組分，導致這種現象的原因是由于這兩個組分各自所含的巰基和二硫鍵數目不同以及膠凝過程中的變化不同所致。7s球蛋白和11s球蛋白的二級結構幾乎沒有什么區別，7s球蛋白是一個具有9個亞基的四元結構，在三級結構中，7s球蛋白中的每一個分子是以-SS-的形式結合；11s球蛋白在三級結構中，在一個分子內，大約有44個胱氨酸殘基側鏈，一部分以-SH形式存在，另一部分以-S-S-形式存在[2]。MTGase（微生物谷氨酰胺轉移酶）會催化誘導大豆分離蛋白中的蛋白疏水基暴露，對大豆分離蛋白形成凝膠網絡結構奠定了基礎，其凝膠強度也相應增強。以大豆分離蛋白為原料，采用超聲波物理改性處理手段與利用MTGase進行誘導制備凝膠、用單因素與正交試驗設計的方法優化凝膠過程，并對比改性與未改性大豆分離蛋白凝膠強度的差別，以獲得性能較好的凝膠，對大豆分離蛋白的工業化轉化有現實的指導意義，同時為MTGase進一步在醫藥及食品領域的廣泛研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

大豆分離蛋白（SPI）：哈高科大豆食品有限責任公司；微生物谷氨酰胺轉移酶（MTGase）：江蘇泰興一鳴精細化工有限公司；其他試劑均為國產分析。

1.2 儀器與設備

超聲波生化儀：廣州省新動力超聲電子設備有限公司；TA-XT2i型質構儀：美國Brookfield；恒溫水浴鍋：北京國華醫療器械廠。

1.3 方法

1.3.1 大豆分離蛋白溶液的制備

準確稱量6.5 g的大豆分離蛋白粉，置于100 mL燒杯中，加入50 mL蒸餾水后，勻速并充分攪拌，使大豆分離蛋白溶液達到均勻、穩定狀態。

1.3.2 未經超聲波改性的大豆分離蛋白凝膠的制備

大豆分離蛋白凝膠的制備：將制備好的大豆分離蛋白溶液放入恒溫水浴鍋內，在90℃溫度下加熱40 min后，迅速將其從水浴鍋中取出，并置于冰水浴中迅速冷卻，直至形成凝膠，然后放入4℃條件下的冰箱內靜置24 h[3]。

1.3.3 大豆分離蛋白凝膠性能的測定

利用制備好的凝膠，采用物性測試儀，探頭類型圓柱型探頭，探頭型號為TA11（25.4 mm DIA、35 mm Long）；前進速度：1.00 mm/s；沖壓速度：0.5 mm/s；后退速度10.00 mm/s；沖壓深度：5.00 mm；觸發類型：自動；觸發力：5.0 g；檢測溫度為室溫，重復3次，取其平均值為試驗結果[4]。

1.3.4 超聲波預處理對SPI凝膠特性影響的研究

將探頭浸入SPI樣品液面以下2 cm并位于液面中間，同時將盛放樣品的燒杯置于冰水浴中，采用超聲波法對大豆分離蛋白分別從對時間和對功率的控制這兩個因素對其強度的影響進行試驗。超聲處理時間t選擇10min和20min，功率P選擇150W和200W。

1.3.5 MTGase對超聲改性后的大豆分離蛋白凝膠強度影響的研究

超聲波預處理SPI條件依據1.3.4試驗結果進行，用MTGase誘導制備大豆分離蛋白凝膠。在前期試驗中發現，加熱時間（t）、加熱溫度（T）、pH 和 MTGase的用量均對大豆分離蛋白凝膠強度有影響，所以選取這4個因素分別對大豆分離蛋白的凝膠強度進行單因素試驗；在單因素試驗基礎上設計正交試驗。

1.3.6 超聲波改性處理與未改性的大豆分離蛋白MTGase誘導凝膠強度對比

經超聲波處理過的大豆分離蛋白與未超聲波處理的大豆分離蛋白，通過MTGase誘導研究其凝膠強度的差異。

2 結果與分析

2.1 超聲波法對SPI凝膠強度影響的結果與分析

超聲波對大豆分離蛋白的改性是物理改性的方法之一，超聲波振蕩處理后大豆分離蛋白分子的內部結構發生了變化，分子間的交互作用力加大，從而緊密交叉聯系在一起，其凝膠強度也隨之改變。超聲波法對大豆分離蛋白凝膠強度影響見表1。

表1 超聲波法對大豆分離蛋白凝膠強度影響的結果Table 1 The influence of ultrasonic method on the gel strength of soy protein isolated

由表1試驗結果表明，隨著超聲時間的延長和功率的增加能提高凝膠強度，而超聲處理功率更能影響到大豆分離蛋白的強度，因此，對于大豆分離蛋白的改性預處理選擇的最佳條件是超聲時間20 min、功率是200 W。

2.2 MTGase對SPI凝膠特性影響的研究

2.2.1 單因素試驗結果

2.2.1.1 加熱時間對MTGase誘導的SPI凝膠強度的影響

加熱時間對MTGase誘導的SPI凝膠強度的影響見圖1。

圖1 作用時間對MTGase催化SPI凝膠強度的影響Fig.1 The effect of time on SPI gel strength induced by MTGase

從圖1可知，當反應時間在1 h～3 h之間時，隨著時間的延長，凝膠強度顯著增加，在3 h時凝膠強度最顯著可達到140 g。在3 h之后，繼續延長反應的時間，凝膠強度呈現明顯下降趨勢，最終達到100 g。因為時間能影響酶促反應的進行，酶會有一個最合適它反應的時間，就在這段時間內，產物也會有所提高，隨著時間的增加，酶的底物逐漸耗盡，酶的濃度也隨之下降，便會影響大豆分離蛋白的凝膠性能，隨著作用時間的延長，MTGase催化樣品的反應越來越慢，導致大豆分離蛋白的凝膠強度呈下降趨勢。

2.2.1.2 加熱溫度對MTGase誘導SPI凝膠強度的影響加熱溫度對MTGase誘導的SPI凝膠強度的影響見圖2。

圖2 反應溫度對MTGase催化SPI凝膠強度的影響Fig.2 The effect of temperature on SPI gel strength induced by MTGase

從圖2可以看出，起初隨著加熱溫度的升高，凝膠強度有明顯上升趨勢，在30℃～50℃范圍內，凝膠強度從最初的90 g達到最高為120 g，但50℃以后，呈下降趨勢，到70℃時，凝膠強度已經降低到80 g。這是由于溫度影響了酶的反應速度，一般升高溫度，酶的反應速度就會加快，但溫度超過一定數值后，反應速度不會再繼續增加，而是受其他因素影響而減慢；加熱溫度還能影響酶的活性，影響MTGase的最適溫度在50℃左右，如果加熱時間過長，酶就會失去活性，失活就會導致變性，一旦變性便失去了原本的功能特性，會引起大豆分離蛋白的凝膠失去水分，蛋白質分子間的交聯作用也會減弱，故導致大豆分離蛋白的凝膠強度的降低。

2.2.1.3 pH對MTGase誘導SPI凝膠強度的影響

pH對MTGase誘導的SPI凝膠強度的影響見圖3。

圖3 pH對MTGase催化SPI凝膠強度的影響Fig.3 The effect of pH on SPI gel strength induced by MTGase

由圖3可以得出，pH在6.0～6.5之間時，凝膠強度是有所增大的，從70 g增大到80 g，但是變化的不明顯；隨著pH的繼續增大，當pH為7.0時，凝膠強度最大，達到了110 g；但從7.0以后，隨著pH的繼續增大，凝膠強度逐漸降低到90 g。說明pH在6.0～8.0范圍內，大豆分離蛋白凝膠強度發生了顯著的變化。研究表明：MTGase的最適pH范圍是6.0～7.5，本試驗結果與之基本一致。只有在特性的pH下，酶與底物才能完美的結合，pH過高或者過低都會降低酶的活性，從而影響大豆分離蛋白的強度，此外如果遠離最適pH時，整個大豆分離蛋白溶液體系的穩定性、溶解性都會受到影響，導致反應的過程中蛋白質之間的靜電作用和疏水作用的平衡受到影響，從而影響蛋白質分子間的凝膠網狀結構。當pH的某一值適合該體系時，蛋白質分子多帶的靜電荷不會減少，此時酶的活性也適合體系的這種環境，較易形成有序的凝膠網狀結構，所以增加了凝膠的強度。

2.2.1.4 MTGase用量對MTGase誘導SPI凝膠強度的影響

MTGase用量對MTGase誘導SPI凝膠強度的影響見圖4。

圖4 酶添加量對MTGase催化SPI凝膠強度的影響Fig.4 The effect of enzyme amount on SPI gel strength induced by MTGase

由圖4可知，酶的用量在10 U/g～30 U/g之間時，隨著MTGase用量的增加，凝膠強度呈上升趨勢較顯著，從70 g最后達到110 g，酶添加量在30 U/g時，凝膠強度達到最大，即110 g；但在酶添加量30 U/g以后，繼續增加酶的用量，凝膠強度突然下降，最后趨于平穩，達到80 g。這說明酶的添加量雖然能改善大豆分離蛋白的凝膠強度，但達到一定用量以后，繼續添加就會妨礙蛋白質分子間形成凝膠的網絡結構，因為被酶催化的蛋白質表面暴露出來的結合位點與酶很快結合在了一起，達到了飽和，而在這些蛋白質周圍的蛋白質則沒有機會與酶進行交聯形成凝膠網絡結構了，在分子外形成的交聯對蛋白質的凝膠不起作用。

2.2.2 MTGase誘導凝膠正交試驗結果與分析

由單因素試驗結果，設計正交試驗，因素水平見表2，結果見表3。

表2 正交試驗因素水平Table 2 Orthogonal factor level table

表3 正交試驗結果Table 3 The Result of Orthogonal test

由表3可知，各因素對MTGase誘導大豆分離蛋白凝膠強度的影響主要依次為加熱時間＞加熱溫度＞pH＞酶添加量，即在加熱時間上影響最大，其次是加熱溫度、pH，酶添加量影響最小。從試驗結果來看，最優組合為A3B2C1D2。綜合各因素的作用，得出適合本試驗的最佳組合條件是加熱時間3 h、加熱溫度50℃、pH 7.0、MTGase添加量30 U/g，在此條件下進行驗證試驗，其凝膠強度達到154.32 g。

2.3 超聲波改性處理與未改性的SPI MTGase誘導凝膠特性對比結果

試驗結果表明，經MTGase誘導對超聲波改性后的大豆分離蛋白凝膠強度高于未經超聲波改性處理的大豆分離蛋白的凝膠強度。兩種方法均能影響大豆分離蛋白的凝膠強度及質構，但前者更為顯著，見表4。

表4 物理改性與未物理改性MTGase誘導SPI凝膠的凝膠強度對比結果Table 4 The gel strength comparison results of physical modification and physical modification SPI induced by MTGase

4 結論

未經超聲處理的SPI通過MTGase誘導，誘導時間 3 h、溫度 50 ℃、pH7.0、MTGase添加量 30 U/g，此條件下獲得的凝膠，其凝膠強度為154.32 g；經超聲波改性處理時間為20 min、功率為200 W的SPI樣品由MTGase誘導，時間 3 h、溫度 50℃、pH7.0、MTGase添加量30 U/g，獲得凝膠其強度為165.84 g。故SPI經超聲改性再由MTGase誘導能顯著提高大豆分離蛋白凝膠的凝膠強度。

[1] 石彥國,李次力,劉穎.大豆制品工藝學[M].2版.北京:中國輕工業出版社,2011

[2] 梁少華,谷克仁,王俊國,等.植物油料資源綜合利用[M].2版.南京:東南大學出版社,2009

[3] 張英華,王麗.前處理對大豆分離的嫩白熱凝膠流變學特性的影響[J].東北農業大學學報,2011,42(2):17-19

[4] 胡坤,趙謀明,林偉峰,等.物理作用力對大豆分離蛋白凝膠質構特性的影響[J].食品科學.2005,26(6):69-75