利用響應(yīng)面法優(yōu)化全蝕病生防菌YB—81的發(fā)酵條件

全鑫等

摘 要：為了優(yōu)化全蝕病生防菌株YB-81的發(fā)酵培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件，提高其對全蝕病的抑制效果，在單因素試驗的基礎(chǔ)上，利用響應(yīng)面法（Response surface methodology）對小麥全蝕病生防菌株YB-81的發(fā)酵條件進行優(yōu)化。生防菌株YB-81的最優(yōu)發(fā)酵條件為：時間36 h，溫度36 ℃，初始pH值8.0，轉(zhuǎn)速200 r·min-1，牛肉膏+葡萄糖（1∶1）0.53%，蛋白胨0.99%，氯化鈉0.20%。在此培養(yǎng)條件下試驗，其菌落總數(shù)為18.8億個·mL-1，較基礎(chǔ)培養(yǎng)基提高了72%，對全蝕病菌抑制率達到87.2%，較優(yōu)化前提高了32.5%。生防菌 YB-81的最優(yōu)發(fā)酵培養(yǎng)條件的確定， 可為該菌大規(guī)模生產(chǎn)應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：小麥全蝕病；生防菌；響應(yīng)面法；發(fā)酵

中圖分類號： S476.1 文獻標(biāo)識碼：A DOI 編碼：10.3969/j.issn.1006-6500.2014.09.013

Abstract： In order to raising the antagonistic effect， the growth conditions and culture medium of biocontrol strain YB-81 was optimized based on single factor test. The optimal culture conditions of the biocontrol strain YB-81 were determined for 0.53% beef extract+glucose（1∶1）， 0.99% peptone， 0.20% odium chloride， temperature at 36 ℃， pH 8.0， speeding at 200 r·min-1， the incubation time of 36 h. The total numbers of colony was 1.88×109·mL-1， improving by 72%， and the inhibition rate to Gaeumannomyces gramims was 87.2%， improving by 32.5% with the optimal growth conditions. The optimal growth condition of the biocontrol strain YB-81 was identified， providing a theoretical basis for enlargement of production.

Key words： wheat take-all；biocontrol strain；response surface methodology；fermentation

小麥全蝕病（Wheat take-all）是一種典型的根部土傳病害，由子囊菌亞門的禾頂囊殼菌小麥變種（Gaeumannomyces gramims var. tritici）侵染所致[1-4]。小麥發(fā)病后，植株根部變黑，分蘗減少，成穗率降低，千粒質(zhì)量下降，甚至全株枯死，減產(chǎn)幅度很大，民間稱此病害為“小麥癌癥”。最近5年，小麥全蝕病擴展迅速，造成嚴(yán)重危害， 且防控困難已經(jīng)成為一種非常頑固的土傳病害。目前，對全蝕病的防治依靠化學(xué)藥劑拌種，常規(guī)藥劑防治效果不好，全蝕凈防效較好但成本太高。

YB-81菌株是河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護研究所利用現(xiàn)代微生物篩選和分子生物學(xué)技術(shù)培育出的對小麥全蝕病具有高效抑制作用的枯草芽孢桿菌，通過室內(nèi)生測試驗以及田間試驗證明對小麥全蝕病菌有較好的防治作用，目前該菌株專利已授權(quán)（專利號2010101 99739.1）。本試驗采用響應(yīng)面法優(yōu)化了該菌株的發(fā)酵條件，目的是為提高該菌株的防病效果，進一步中試生產(chǎn)，為應(yīng)用于大田提供理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材 料

供試菌株及培養(yǎng)基：枯草芽孢桿菌YB-81和小麥全蝕病菌（Gaeumannomyces gramims var. tritici）均由河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護研究所提供。基礎(chǔ)培養(yǎng)基為NA培養(yǎng)基，小麥全蝕病菌培養(yǎng)基為PDA。

1.2 方 法

1.2.1 生長量的測定 采用平板菌落計數(shù)法[5]。各處理培養(yǎng)液用梯度稀釋法稀釋涂板后，37 ℃恒溫倒置培養(yǎng)36～48 h，調(diào)查平板菌落數(shù)，然后計算活菌數(shù)（cfu·mL-1）。

1.2.2 抑菌率測定 抑菌率的測定采用含毒介質(zhì)法[6]。

1.2.3 發(fā)酵條件優(yōu)化 通過單因素試驗，測定不同時間、溫度、初始pH值、藥瓶轉(zhuǎn)速對YB-81菌株發(fā)酵效果的影響。

1.2.4 響應(yīng)面優(yōu)化試驗 響應(yīng)面法優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基試驗設(shè)計，選取對發(fā)酵培養(yǎng)基有顯著影響的3個因素即碳源、氮源及無機離子，采用單因素試驗方法確定3個因素的試驗點，每個因素選擇2個水平，測定各發(fā)酵培養(yǎng)基中芽孢桿菌的生長量。在單因素試驗的基礎(chǔ)上，根據(jù)Box-Behnken中心組合設(shè)計原理，選取碳源牛肉膏+葡萄糖（1∶1） （g）、氮源蛋白胨（g）、無機離子氯化鈉（g）3個因素來研究發(fā)酵培養(yǎng)基最佳條件，以菌落總數(shù)為響應(yīng)值，利用Design-Exper.8.05軟件設(shè)計了3因素3水平的響應(yīng)面試驗（表1）。

2 結(jié)果與分析

2.1 最優(yōu)發(fā)酵條件

通過設(shè)置不同時間、溫度、初始pH值、搖瓶轉(zhuǎn)速優(yōu)化菌株YB-81的發(fā)酵條件，結(jié)果如圖1～圖4所示。菌落總數(shù)與抑菌率的變化趨勢基本一致，菌落總數(shù)越高，抑菌率也越高。發(fā)酵時間36 h抑制率達最高80.6%，菌落總數(shù)16.6億個·mL-1；隨著發(fā)酵溫度的上升菌落總數(shù)逐漸增多，在36 ℃時發(fā)酵代謝物此時的抑菌作用最強，菌落生長總數(shù)也最多，40 ℃ 時抑制率明顯降低；pH值8.0時，抑制率和菌落總數(shù)均在最高點，與其他處理差異顯著；芽孢桿菌在5個不同搖床轉(zhuǎn)速條件下，抑制率變化不明顯，菌落總數(shù)逐漸增多，在200 r·min-1菌落總數(shù)達到最大值16.2億個·mL-1。

2.2 生防芽孢桿菌YB-81發(fā)酵培養(yǎng)基試驗設(shè)計

通過單因素試驗，得出發(fā)酵培養(yǎng)基（100 mL）中最佳碳源葡萄糖+牛肉膏（1∶1）添加量為0.5 g，最佳氮源蛋白胨1.0 g，最佳無機離子氯化鈉0.20 g。

2.3 響應(yīng)面法優(yōu)化培養(yǎng)基

2.3.1 響應(yīng)面優(yōu)化試驗 以菌落總數(shù)為響應(yīng)值，利用Design-Exper.8.05軟件設(shè)計了3因素3水平的響應(yīng)面試驗，菌落總數(shù)響應(yīng)曲面分析試驗結(jié)果見表2。

根據(jù)軟件對表2中試驗結(jié)果進行多元回歸擬合，得到生防芽孢桿菌培養(yǎng)基設(shè)計過程中A碳源、B氮源、C無機離子的二次多項回歸模型：

Y=+177.60+2.00A-5.88B+1.62C+9.75AB+0.25AC-1.50BC-88.30A2-27.05B2-45.55C2

2.3.2 響應(yīng)曲面方差分析 通過表3可以看出，該模型的F值為38.03說明模型是顯著的，各因素中BC和B2顯著；均二次方A2、C2極顯著。

2.3.3 響應(yīng)曲面圖與等高值線圖的分析 交互效應(yīng)的強弱可用等高線的形狀來映出， 橢圓形表示兩因素交互作用顯著， 而圓形則與之相反。由圖4～圖6可知，碳源葡萄糖+牛肉膏（1∶1）（A）、氮源蛋白胨（B）、無機離子氯化鈉（C）之間的相互作用對菌落總數(shù)的影響。

如圖中4所示，碳源與氮源之間存在交互作用，當(dāng)碳源在零水平時，在氮源增加的同時，菌落總數(shù)也逐漸增加，當(dāng)碳源超過0.5 g以后，菌落總數(shù)不再增加。從等高線圖中可直觀看出兩因素交互作用不顯著。

圖5顯示了碳源與無機離子之間交互作用不顯著，從其等高線可直觀看出，因為等高線的形狀反應(yīng)了交互效應(yīng)的強弱大小，圓形表示兩個因素作用不顯著。

由圖6可知，把氮源加入量固定于零水平（1.0 g）時，氮源與培養(yǎng)基中無機離子交互影響效應(yīng)特點是：隨著氮源的變化，菌落總數(shù)先上升后降低；適當(dāng)?shù)脑黾拥纯梢詼p少一定量無機離子。說明氮源與無機離子有一定的交互作用。

以上3個響應(yīng)面均為開口向下，說明響應(yīng)值（菌落總數(shù)）存在極大值，3個圖形的等高線中心均位于-1～1之間，表明培養(yǎng)基最優(yōu)條件存在于所設(shè)計的因素水平范圍之內(nèi)。模型培養(yǎng)基優(yōu)化條件為：碳源0.53 g，氮源0.99 g， 無機離子0.20 g，在此條件下，模型預(yù)測菌落總數(shù)為168.408 ×107個·mL-1。

2.3.4 模型驗證 通過Plackett-Burman試驗設(shè)計篩選出全蝕病生防菌株YB-81發(fā)酵培養(yǎng)基的3個影響因素，模型理論條件牛肉膏+葡萄糖（1∶1）0.53%，蛋白胨0.99%，氯化鈉0.20%，這3個主要因素對菌株YB-81生長條件存在顯著影響。在此條件下進行驗證試驗，經(jīng)3次平行驗證試驗，取平均值，實際菌落總數(shù)為18.8億個·mL-1，與模型預(yù)測值基本相符，比基礎(chǔ)培養(yǎng)基提高了72%，對全蝕病菌抑制率達到87.2%，較優(yōu)化前提高了32.5%。

3 結(jié)論與討論

小麥全蝕病是小麥上的一種毀滅性病害，民間俗稱“小麥癌癥”。 枯草芽孢桿菌YB-81菌株經(jīng)過室內(nèi)生測、盆栽試驗、田間試驗已驗證其對小麥全蝕病有較好的抑制作用，同時通過拌種處理，菌株進入土壤，能夠改善土壤環(huán)境，對小麥全蝕病的長期預(yù)防與防治大有益處。目前該菌株專利已授權(quán)（專利號2010101 99739.1）。利用該生防菌株研發(fā)的微生物菌劑已經(jīng)得到了農(nóng)業(yè)部農(nóng)藥大田試驗批準(zhǔn)證書（農(nóng)藥試驗證號：SY201001691），已完成農(nóng)藥大田試驗，正在登記，該菌株在生產(chǎn)上的應(yīng)用前景廣泛。

在大規(guī)模生產(chǎn)菌劑前，對菌株YB-81的發(fā)酵條件進行優(yōu)化，能夠確定一套產(chǎn)率最大、最節(jié)約的發(fā)酵模式。傳統(tǒng)上對于生防菌株的發(fā)酵通常采用單因素試驗和正交試驗相結(jié)合的方法[7-11]，本研究在單因素試驗基礎(chǔ)上采用響應(yīng)面分析法對試驗結(jié)果進行數(shù)學(xué)模擬和優(yōu)化，直觀、可信度高[12]，最終確定了一系列最優(yōu)發(fā)酵條件，使其對小麥全蝕病菌的抑制率提高32.5%，菌落總數(shù)提高72%。

本試驗中對生防菌株的發(fā)酵優(yōu)化是在搖瓶發(fā)酵的基礎(chǔ)上進行的，當(dāng)菌株進一步中試生產(chǎn)時，可以此發(fā)酵模式為基礎(chǔ)，但發(fā)酵罐中的發(fā)酵條件還需進一步的驗證及研究。

參考文獻：

[1] 高照良， 商鴻生. 小麥全蝕病發(fā)病因素研究進展[J]. 麥類作物學(xué)報， 1999， 19（6）： 63-65.

[2] 司劍林. 小麥全蝕病的發(fā)生規(guī)律及防治技術(shù)[J]. 現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技， 2009 （16）： 135-135.

[3] James C R. Review Take-all of wheat [J]. Physiological and Molecular Plant Pathology，2003， 62： 73-86.

[4] 王翠，燕照玲，施艷，等.河南省小麥全蝕病菌變種類型鑒定[J]. 河南農(nóng)業(yè)科學(xué)，2013（5）： 97-100.

[5] 李華. 平板菌落計數(shù)的改進方法[J]. 生物學(xué)通報， 2006，41（1）： 51-51.

[6] 孫廣宇， 宗兆峰. 植物病理學(xué)實驗技術(shù)[M]. 北京：中國農(nóng)業(yè)出版社， 2002： 142-143.

[7] Ing-Lung Shih， Chia-Yu Kuo， Feng-Chia Hsieh， et al.Use of surface response methodology to optimize culture conditions for iturin A production by Bacillus subtilis in solid-state fermentation[J]. Journal of the Chinese Institute of Chemical Engineers， 2008， 39（6）： 635-643.

[8] Li Rui-fang，XU Yi. Fermentation optimization to improve production of antagonistic metabites by Bacillus subtilis strain BS501a[J]. Journal of Central South university， 2011，18（4）：1 047-1 053.

[9] 陸繼臣，遲乃玉，竇少華，等. 響應(yīng)面法優(yōu)化灰霉病生防菌CNY-04培養(yǎng)條件[J]. 微生物學(xué)通報， 2013， 40（8）： 1 414-1 422.

[10] 曹冬梅，胡耀輝. 基于響應(yīng)面法優(yōu)化HY15發(fā)酵生產(chǎn)β-環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶的發(fā)酵條件[J]. 東北林業(yè)大學(xué)學(xué)報， 2012， 40（1）： 97-100.

[11] 孫會強，周賽男，譚周進， 等. 一株煙草內(nèi)生拮抗放線菌發(fā)酵條件優(yōu)化[J]. 應(yīng)用與環(huán)境生物學(xué)報， 2011， 17（6）： 914-917.

[12] 張文芝，郭堅華. 微生物發(fā)酵工藝優(yōu)化研究進展[J]. 廣東農(nóng)業(yè)科學(xué)， 2013，40（6）： 114-117.