多酚氧化酶活性抑制的研究進(jìn)展

熊志強(qiáng),周 磊,劉 偉

(南昌大學(xué) 食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,江西南昌330047)

多酚氧化酶活性抑制的研究進(jìn)展

熊志強(qiáng),周 磊,劉 偉*

(南昌大學(xué) 食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,江西南昌330047)

多酚氧化酶(PPO)廣泛地存在于各種植物、動(dòng)物、真菌、細(xì)菌等機(jī)體中,是引起酶促褐變的主要原因。在食品貯藏和加工過(guò)程中,通常采用相關(guān)技術(shù)手段抑制PPO的活性,從而保證食品的營(yíng)養(yǎng)、風(fēng)味以及外觀品質(zhì)等在一定時(shí)間范圍內(nèi)不被破壞。本文從PPO的抑制出發(fā),綜述了不同抑制方法對(duì)PPO活性的影響,PPO抑制動(dòng)力學(xué),去折疊態(tài)PPO的構(gòu)象變化及去折疊模型的研究進(jìn)展,并對(duì)其研究的發(fā)展趨勢(shì)進(jìn)行了展望。

多酚氧化酶,活性抑制,動(dòng)力學(xué),構(gòu)象,去折疊

多酚氧化酶(Polyphenoloxidase,PPO)是一種含銅的氧化還原酶,除了廣泛地存在于各種植物中,在動(dòng)物、真菌、細(xì)菌等機(jī)體中也發(fā)現(xiàn)了PPO,其活性因其序列、結(jié)合位點(diǎn)、糖基化和活化程度等的不同而各有差異[1]。在廣義上,它可以分為單酚氧化酶(酪氨酸酶)、雙酚氧化酶(兒茶酚氧化酶)、漆酶。果蔬在貯藏、運(yùn)輸及加工的過(guò)程中往往會(huì)發(fā)生一定程度的酶促褐變,嚴(yán)重影響其營(yíng)養(yǎng)、風(fēng)味以及外觀品質(zhì)等,這是由于PPO在有氧條件下可將酪氨酸羥基化為鄰二酚或?qū)⒍友趸舌忰?然后鄰醌自發(fā)地與氨基酸和蛋白質(zhì)發(fā)生聚合作用使組織變色,形成褐色素或黑色素從而造成果蔬品質(zhì)劣變和營(yíng)養(yǎng)成分破壞[2]。因此,從食品工業(yè)發(fā)展的角度,采用相關(guān)技術(shù)手段對(duì)PPO進(jìn)行抑制和鈍化,有效地控制酶促褐變反應(yīng),并對(duì)其相關(guān)機(jī)理進(jìn)行研究十分重要。目前,有關(guān)PPO的報(bào)道越來(lái)越多,對(duì)PPO的研究也日趨成熟,本文從PPO的抑制出發(fā),對(duì)其活性、抑制動(dòng)力學(xué)、構(gòu)象變化及去折疊模型方面的研究進(jìn)行綜述。

1 不同抑制方法對(duì)PPO活性的影響

從抑制和鈍化活性層面考慮,到目前為止,PPO的抑制主要采用物理法、化學(xué)法以及多種處理手段相結(jié)合的方法。

1.1 物理法

物理法抑制PPO是近幾年來(lái)PPO活性抑制研究中較為常見的處理手段之一,可以分為以下兩大類:

1.1.1 加熱法 在所有的物理法中,加熱法是在食品加工中運(yùn)用的最成熟、廣泛而又高效的方法,近年來(lái)加熱法抑制PPO活性仍有報(bào)道,如Gouzi等[3]報(bào)道過(guò)熱處理對(duì)雙孢菇PPO活性的影響,在恒溫水浴鍋中,將PPO在45、50、55、60 ℃下分別加熱30 min,結(jié)果發(fā)現(xiàn)PPO的活性隨著處理溫度的上升而逐漸降低,尤其是在60 ℃加熱30 min時(shí),PPO完全失去活性。Navarro等[4]報(bào)道了在60 ℃(pH7.0、5.5)條件下柿子PPO的活性在較長(zhǎng)時(shí)間范圍內(nèi)十分穩(wěn)定,當(dāng)溫度增加到70 ℃(pH7.0、5.5)時(shí),其相對(duì)活性分別減為60%、30%。除了水浴加熱外,還有其他加熱方式,如Ndiaye等[5]采用蒸汽熱燙處理芒果PPO,其活性在5 min后僅為原始酶活的1.71%,幾乎完全受到抑制,且根據(jù)色差參量(a、b、L值等)的變化,發(fā)現(xiàn)蒸汽熱燙處理芒果切片還能產(chǎn)生良好的護(hù)色效果。Yildiz等[6]用電阻加熱處理葡萄PPO,在20、30 V/cm電壓陡度下加熱到70 ℃后,其活性逐漸降低。

1.1.2 其他物理法 除了傳統(tǒng)的加熱法,還有很多物理方法能夠?qū)PO產(chǎn)生抑制作用,主要有:

高壓機(jī)械處理:Garcia等[7]在400、600、800 MPa的靜高壓下處理紅樹薯5～15 min,其PPO的活性隨著壓力上升和處理時(shí)間的增加而逐漸減小。不同類型的壓力對(duì)PPO表現(xiàn)出不同的作用效果,在本課題組前期的研究中報(bào)道過(guò)動(dòng)態(tài)高壓微射流(DHPM)處理梨汁PPO,發(fā)現(xiàn)隨著壓力的上升,PPO的相對(duì)活性逐漸升高[8]。

紫外處理:紫外線照射能使酶的活性降低,并改變其結(jié)構(gòu),主要通過(guò)以下兩種方式:由蛋白質(zhì)本身或發(fā)色團(tuán)對(duì)輻照的吸收引起的直接光氧化;由蛋白質(zhì)聚合物或其他色素的能量轉(zhuǎn)變產(chǎn)生單線態(tài)氧引起的間接蛋白質(zhì)氧化[9]。Manzocco等[10]在緩沖液系統(tǒng)和蘋果派生品中用可見光和紫外光處理并進(jìn)行對(duì)比,發(fā)現(xiàn)PPO的活性只有在較高強(qiáng)度的可見光(輻照度≥11.7 W/m2)下處理10 h以上才會(huì)受到抑制,而在波長(zhǎng)253.7 nm不同強(qiáng)度的紫外光照射下,PPO的活性在整個(gè)強(qiáng)度范圍內(nèi)都受到抑制,且隨照射強(qiáng)度的增加活性逐漸降低,這可能是由于紫外照射產(chǎn)生熱變性從而使蛋白質(zhì)發(fā)生聚合。

微波處理:Latorre等[11]報(bào)道用微波(935 W,3 min)處理紅甜菜PPO,雖然能夠降低80%左右的活性,但是會(huì)破壞其色澤、質(zhì)地和感官品質(zhì)。Palma-Orozco等[12]也報(bào)道90 W的微波處理曼密蘋果PPO,在165 s時(shí)間內(nèi),其活性逐漸上升,而增加處理時(shí)間后,PPO的活性逐漸降低,這可能是微波處理一段時(shí)間后產(chǎn)生了一定的熱效應(yīng)。

脈沖電場(chǎng)處理:Zhong等[13]報(bào)道PPO在25 kV/cm的脈沖電流中處理744 μs后,其相對(duì)活性降為原始活性的76.2%。Luo等[14]也采用脈沖電場(chǎng)處理PPO,結(jié)果表明,隨著脈沖電場(chǎng)強(qiáng)度的增加,PPO的活性逐漸降低,用12 kV/cm脈沖電場(chǎng)處理325 μs后,其相對(duì)活性降為原始活性的31%。

1.2 化學(xué)法

化學(xué)法通常是通過(guò)添加抑制劑以抑制PPO,酶抑制劑種類繁多,抑制機(jī)理比較復(fù)雜,不同類型的抑制劑其抑制機(jī)理也各不相同,如螯合劑與酶分子中銅離子結(jié)合[15],與酶分子競(jìng)爭(zhēng)底物的結(jié)合位點(diǎn)[16],或與活性中心以外的親和集團(tuán)形成復(fù)合物,產(chǎn)生空間位阻[17]等。主要方法有:

SO2及其亞硫酸鹽法:SO2或亞硫酸鹽是使用較早的化學(xué)抑制劑,如Gao等[18]報(bào)道用1.0 mmol/L亞硫酸鈉處理白花菜菜葉PPO后,其活性僅為原始活性的18%。王偉等[19]也報(bào)道過(guò)亞硫酸氫鈉能不可逆地與醌生成無(wú)色的加成產(chǎn)物,直接作用于酶,降低其與酚類物質(zhì)作用的活力。

酸處理:酸處理是化學(xué)處理手段中用的較多的方法之一,近幾年來(lái),有機(jī)酸的使用相對(duì)較多,主要有檸檬酸、抗壞血酸、草酸、對(duì)-烷基苯甲酸。有機(jī)酸可能對(duì)銅離子位點(diǎn)具有較強(qiáng)的螯合作用[20],但也可能是酸的存在改變了酶促反應(yīng)體系的pH,由于不同來(lái)源的PPO都存在其相應(yīng)的最適pH,故pH的變化導(dǎo)致酶活性發(fā)生改變。本課題組報(bào)道過(guò)用不同濃度檸檬酸處理蘑菇PPO,當(dāng)檸檬酸濃度達(dá)到60 mmol/L時(shí),PPO的活性明顯受到抑制[21]。有報(bào)道認(rèn)為抗壞血酸不是與PPO直接反應(yīng),而是通過(guò)減少被氧化底物來(lái)遏制褐變的發(fā)生[22]。Huang等[23]發(fā)現(xiàn)草酸能夠較好地抑制儲(chǔ)藏過(guò)程中酶促褐變反應(yīng)對(duì)香蕉感官品質(zhì)的影響。Lin等[24]發(fā)現(xiàn)對(duì)-烷基苯甲酸對(duì)馬鈴薯PPO有較強(qiáng)的抑制作用,六種抑制劑的抑制強(qiáng)度順序?yàn)?對(duì)-丙基苯甲酸<對(duì)-叔丁基苯甲酸<對(duì)-戊基苯甲酸<對(duì)-己基苯甲酸<對(duì)-庚基苯甲酸<對(duì)-辛基苯甲酸。

阿魏酸、兒茶素及其他抑制劑:有文章報(bào)道阿魏酸和兒茶素能與酶促褐變反應(yīng)的中間產(chǎn)物作用,抑制多巴色素的形成[25]。除了上述抑制劑,還有其他抑制劑對(duì)PPO有一定的抑制作用,如SDS[26]、EDTA[27]、谷胱甘肽[27]、β-巰基乙醇[28]等,但不同的抑制劑其抑制機(jī)理各不相同。

PPO的來(lái)源很廣泛,這就必然造成不同種類的PPO之間存在一定的差異性,相同抑制劑對(duì)不同PPO產(chǎn)生的抑制效果也會(huì)不一樣。某些物質(zhì)作為抑制劑并不是絕對(duì)的,低濃度時(shí)可能是激活劑[29],這也說(shuō)明抑制劑的濃度是影響酶活性的重大因素。除此之外,還應(yīng)考慮被作用的酶濃度的大小。

1.3 多種處理手段相結(jié)合

單種處理手段對(duì)抑制酶的活性往往存在很大的局限性,為了更加有效地抑制PPO的活性,遏制酶促褐變的發(fā)生,采用了多種方式結(jié)合并用的處理手段,包括物理結(jié)合化學(xué)法、物理法的疊加、多種化學(xué)抑制劑的共同作用。主要有:

靜高壓和CO2、熱結(jié)合處理:Ortuo等[30]利用靜高壓和CO2結(jié)合處理費(fèi)約果泥,在相同壓力下,加入一定量的CO2能更好地抑制酶活,不同的靜高壓和CO2處理對(duì)PPO的抑制作用也各不相同。有報(bào)道還將高壓和熱抑制相結(jié)合,不同的溫度和壓力下,對(duì)蘋果PPO的抑制作用各不相同,在壓力超過(guò)300 MPa時(shí),壓力和溫度對(duì)抑制酶的活性起著良好的協(xié)同作用[31]。

超聲結(jié)合酸、熱等處理:超聲處理對(duì)PPO的活性有一定的激活作用[32],而超聲和其他一些方式相結(jié)合能更好地抑制酶的活性。物理和化學(xué)法相結(jié)合中常用超聲處理與某些抑制劑相結(jié)合作用于PPO,如Jang等[33]發(fā)現(xiàn)超聲結(jié)合抗壞血酸對(duì)鮮切后的蘋果儲(chǔ)藏過(guò)程中PPO的抑制具有良好的協(xié)同作用。Niu等[34]發(fā)現(xiàn)超聲結(jié)合抗壞血酸或谷胱甘肽能有效地抑制PPO的活性,遏制全麥生面條的酶促褐變,且兩種結(jié)合方式中超聲結(jié)合抗壞血酸的抑制效果更加明顯。本課題組也報(bào)道過(guò)超聲結(jié)合中等濃度的蘋果酸能顯著地降低PPO的活性[35]。除了和酸結(jié)合外,超聲還可以與熱處理共同作用,Cheng等[36]研究發(fā)現(xiàn)超聲處理15 min后對(duì)PPO的活性幾乎沒(méi)有影響,熱處理(60 ℃)15 min后蘑菇PPO的活性大概降低了77.7%,而在同樣溫度下熱超聲處理15 min后,PPO的相對(duì)活性只有1.0%,說(shuō)明熱超聲比超聲及熱處理單獨(dú)作用能更好地抑制PPO的活性。

物理法的疊加處理:紫外輻照和脈沖電場(chǎng)相結(jié)合對(duì)蘋果PPO具有一定的抑制作用,其效果雖不及熱處理,但能夠更好地保持蘋果汁的品質(zhì)[37]。

抑制劑的結(jié)合處理:抑制劑的結(jié)合使用也是一種有效的抑制途徑,如Kim等[38]發(fā)現(xiàn)用殼聚糖包裹抗壞血酸棕櫚酸酯能提高對(duì)PPO的抑制作用,Arias等[22]報(bào)道抗壞血酸與4-己基間苯二酚(4-HR)結(jié)合比單獨(dú)使用兩種抑制劑的效果較好,兩者具有良好的協(xié)同效應(yīng)。

2 PPO的抑制動(dòng)力學(xué)

抑制劑的使用在解釋催化反應(yīng)機(jī)制上有很大的價(jià)值,抑制劑又分為可逆抑制劑和不可逆抑制劑,通過(guò)研究抑制動(dòng)力學(xué),可以有效地判斷抑制劑對(duì)酶促反應(yīng)的抑制類型。

2.1 可逆抑制

可逆抑制劑與PPO之間的酶促反應(yīng)的抑制類型有競(jìng)爭(zhēng)性抑制、非競(jìng)爭(zhēng)性抑制、混合型抑制及反競(jìng)爭(zhēng)性抑制。經(jīng)過(guò)不同可逆抑制劑處理后的PPO,測(cè)定不同底物(如鄰苯二酚、對(duì)叔丁基鄰苯二酚、L-多巴等)濃度下酶促反應(yīng)的初速率,根據(jù)米氏方程V=Vmax[S]/(Km+[S]),以1/[S]對(duì)1/V作Lineweaver-Burk雙倒數(shù)圖,從而求得抑制動(dòng)力學(xué)參數(shù)(Km、Vmax)。

2.1.1 競(jìng)爭(zhēng)性抑制 在可逆抑制劑中,最常見的是競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑,如Si等[39]報(bào)道用橙皮素處理蘑菇酪氨酸酶的半抑制濃度(IC50)為8.13×10-5mol/L,隨著橙皮素濃度的增加,酪氨酸酶的Vmax值不變,Km值增大,為競(jìng)爭(zhēng)性抑制。高興祥等[40]研究了不同濃度曲酸對(duì)甜菜夜蛾P(guān)PO的抑制作用,發(fā)現(xiàn)曲酸濃度的變化會(huì)影響Km的變化,但對(duì)最大反應(yīng)速度Vmax幾乎沒(méi)有影響,可以判斷曲酸為甜菜夜蛾P(guān)PO的競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑。Batista等[41]根據(jù)抑制動(dòng)力學(xué)規(guī)律推知L-半胱氨酸對(duì)茄屬植物PPO抑制作用類型為競(jìng)爭(zhēng)性抑制。Qiu等[42]采用5.0 mmol/L α-氰基-4-羥基肉桂酸處理蘑菇酪氨酸酶,其活性變?yōu)樵蓟钚缘?9.1%。隨著抑制劑濃度的增加,Vmax值不變,Km值增大,抑制類型屬于競(jìng)爭(zhēng)性抑制。最近的文章中還提到桑色素[43]和水楊酸[29]與PPO催化反應(yīng)的抑制類型均表現(xiàn)為競(jìng)爭(zhēng)性抑制。

2.1.2 非競(jìng)爭(zhēng)性抑制 競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑能與底物爭(zhēng)奪酶分子的活性位點(diǎn),而在非競(jìng)爭(zhēng)性抑制中,抑制劑和底物分別與酶分子相結(jié)合,且互不影響。Nirmal等[25]報(bào)道隨著阿魏酸濃度的增加,Km值不變,Vmax值減小,表現(xiàn)為非競(jìng)爭(zhēng)性抑制。本課題組發(fā)現(xiàn)隨著檸檬酸濃度的增加,PPO的Vmax值逐漸減小,檸檬酸濃度為40 mmol/L時(shí),Vmax為原酶的19.3%;但不同檸檬酸處理過(guò)的PPO的Km幾乎沒(méi)有什么變化,這表明檸檬酸對(duì)蘑菇PPO催化鄰苯二酚反應(yīng)是一種非競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑[44]。Batista等[41]報(bào)道硫脲、焦亞硫酸鈉對(duì)茄屬植物PPO的抑制類型為非競(jìng)爭(zhēng)性抑制。Lin等[45]報(bào)道迷迭香酸和迷迭香酸甲酯對(duì)蘑菇酪氨酸酶的抑制模式均表現(xiàn)為非競(jìng)爭(zhēng)性抑制。

2.1.3 混合型抑制 混合型抑制也叫混合型非競(jìng)爭(zhēng)性抑制,是一種較復(fù)雜的非競(jìng)爭(zhēng)性抑制。Nirmal等[25]發(fā)現(xiàn)兒茶素能與酶及酶-底物混合物以不同的親和力相結(jié)合,隨著兒茶素濃度的增加,Km值增大,Vmax值減小,對(duì)PPO的抑制模式為混合型。Si等[46-47]發(fā)現(xiàn)胡椒酸及波爾定堿對(duì)酪氨酸酶的抑制模式均為混合型。Arias等[22]用0.2 mmol/L 4-HR處理梨PPO后,發(fā)現(xiàn)Km值增大;Vmax值減小,其抑制類型表現(xiàn)為混合型,4-HR對(duì)PPO具有雙重作用,在無(wú)底物存在時(shí),它能較好地使PPO以脫氧的形式失去活性;在有底物存在時(shí),它能與底物相互競(jìng)爭(zhēng)催化位點(diǎn)。Lin等[45]發(fā)現(xiàn)隨著胡麻黃素濃度的增加,Km和Vmax值均減小,且Km/Vmax的比值(雙倒數(shù)圖斜率)發(fā)生變化,表現(xiàn)為混合型抑制。

2.1.4 反競(jìng)爭(zhēng)性抑制 在一底物反應(yīng)中,反競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑則相對(duì)較少,這種抑制劑是與酶活性位點(diǎn)以外的部位結(jié)合,但不影響酶與底物的結(jié)合。高夢(mèng)祥等[48]報(bào)道過(guò)VC對(duì)蓮藕PPO有較強(qiáng)的抑制作用,表現(xiàn)為褐變推遲出現(xiàn),當(dāng)VC濃度為5 mg/L時(shí),滯后時(shí)間達(dá)到40 min左右。根據(jù)動(dòng)力學(xué)方程顯示,Km和Vmax值均減小,且Km/Vmax的比值一直不變,呈現(xiàn)反競(jìng)爭(zhēng)性抑制。

2.2 不可逆抑制

上述抑制類型均屬于可逆抑制,除此之外,酶抑制還存在不可逆抑制。不可逆抑制程度隨著抑制劑的濃度和抑制時(shí)間的增加而增強(qiáng),不能通過(guò)米氏方程來(lái)判斷該類抑制作用,但可以用動(dòng)力學(xué)方法加以區(qū)別。固定反應(yīng)底物濃度,用不同濃度抑制劑作用于酶,以酶量為橫坐標(biāo),酶促反應(yīng)速率為縱坐標(biāo)作圖,若得到的曲線均通過(guò)原點(diǎn),為可逆抑制;若得到的是一組平行線,則為不可逆抑制。楊定乾等[49]以菠蘿中的活性組分抑制雙孢菇酪氨酸酶,按照上述方法作圖發(fā)現(xiàn)三條曲線呈平行關(guān)系,為不可逆抑制。章思思等[50]報(bào)道氨基葡萄糖(G-NH2)對(duì)酪氨酸酶的抑制機(jī)理曲線是一組平行線,斜率基本不變,為不可逆抑制。

3 去折疊態(tài)PPO的構(gòu)象變化及去折疊模型

蛋白質(zhì)變性過(guò)程中存在三種狀態(tài):天然態(tài)、中間態(tài)、去折疊態(tài)。在變性過(guò)程中,蛋白質(zhì)從天然態(tài)直接轉(zhuǎn)變?yōu)槿フ郫B態(tài)稱為“二態(tài)模型”,從天然態(tài)變?yōu)椴糠终郫B中間態(tài),并最終轉(zhuǎn)變?yōu)槿フ郫B態(tài)稱為“三態(tài)模型”[51]。去折疊態(tài)(即變性態(tài))是蛋白質(zhì)獨(dú)特的三級(jí)結(jié)構(gòu)瓦解而喪失相應(yīng)生物學(xué)功能的一種存在形式[52]。用上述各種手段處理PPO,往往是使蛋白質(zhì)從折疊態(tài)轉(zhuǎn)變到去折疊態(tài)的一個(gè)過(guò)程,在整個(gè)過(guò)程中,除了PPO的活性發(fā)生了改變,其分子構(gòu)象也發(fā)生了很大的變化。

3.1 去折疊態(tài)PPO二級(jí)結(jié)構(gòu)的變化

在蛋白質(zhì)或多肽中,主要的光活性基團(tuán)是肽鏈骨架中的肽鍵、芳香氨基酸殘基及二硫鍵,正是由于這些基團(tuán)的存在才會(huì)使蛋白質(zhì)具有圓二色性,通常以平均殘基橢圓率(θ)表示。目前常采用多功能圓二色光譜儀掃描得到遠(yuǎn)紫外(178～250 nm)CD光譜來(lái)考察蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的變化。一般蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)中α-螺旋在208、222 nm附近有負(fù)的特征吸收峰,β-折疊在216 nm附近有負(fù)的特征吸收峰[53],吸收峰的位置、強(qiáng)弱因蛋白質(zhì)的不同而略有差異。除了用CD光譜來(lái)表征蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)外,還可以用傅立葉變換紅外光譜對(duì)一定波數(shù)的掃描差譜曲線進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析。

Luo等[14]在用脈沖電場(chǎng)處理PPO并研究其構(gòu)象變化,當(dāng)脈沖電流從8 kV/cm增加到20 kV/cm并處理52 μs時(shí),發(fā)現(xiàn)PPO的活性從原始活性的94%降低至80%,二級(jí)結(jié)構(gòu)中α-螺旋含量從56%下降至21%,而β-折疊含量則從11%上升至41%。在脈沖電流為12 kV/cm時(shí),β-折疊的負(fù)吸收峰從215 nm偏移到了218 nm。Yi等[54]報(bào)道用靜高壓(1600 MPa,1 min)處理雙孢菇PPO,其活性變?yōu)樵蓟钚缘?.8%,經(jīng)處理后的PPO二級(jí)結(jié)構(gòu)中α-螺旋含量下降了7.7%,β-折疊上升了7.9%,且發(fā)現(xiàn)α-螺旋的減少會(huì)引起酶活性位點(diǎn)的機(jī)能障礙,從而導(dǎo)致酶的部分或者完全失活。Kanade等[26]報(bào)道在SDS及酸性條件對(duì)PPO的抑制過(guò)程中,α-螺旋的含量都有所下降。在Li等[55]的研究中發(fā)現(xiàn)經(jīng)過(guò)30 MPa高壓CO2(HPCD)處理5～60 min后,蘋果PPO的相對(duì)活性降低了55%,隨著溫度、壓力、處理時(shí)間和周期的增加,橢圓率上升,α-螺旋含量下降,β-折疊含量增加;隨著溫度、壓力和周期的增加,β-轉(zhuǎn)角含量下降;隨著溫度、壓力和時(shí)間的增加,無(wú)規(guī)則卷曲含量下降。誘導(dǎo)方式不同,PPO的二級(jí)結(jié)構(gòu)的變化可能也會(huì)不同,本課題組用DHPM處理蘑菇PPO,其二級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生了明顯的變化,但各組分含量并不是隨著壓力的遞增而有規(guī)律地變化[56];在用檸檬酸對(duì)PPO的改性中,PPO的負(fù)橢圓率隨檸檬酸濃度的增加而變大,α-螺旋含量逐漸下降,β-折疊含量逐漸增加,β-轉(zhuǎn)角和無(wú)規(guī)則卷曲含量有略微增加,但不是很明顯[21]。Shi等[57]通過(guò)傅立葉變換紅外光譜發(fā)現(xiàn)在高pH(pH10.0)時(shí),α-螺旋和β-折疊含量迅速減少,β-轉(zhuǎn)角和無(wú)規(guī)則卷曲含量迅速增加。劉野等[58]用HPCD(30 MPa,60 min)處理PPO后,其活性為原始活性的16.0%,隨著處理壓強(qiáng)的升高,PPO氨基酸殘基的總體吸光度升高,峰形越來(lái)越尖銳,在1652 cm-1和1646 cm-1附近的峰強(qiáng)增大,α-螺旋和β-轉(zhuǎn)角含量升高,β-折疊含量降低。

3.2 去折疊態(tài)PPO三級(jí)結(jié)構(gòu)的變化

關(guān)于蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)的研究,常用到X射線晶體衍射分析、核磁共振波譜(NMR)分析、同步熒光光譜分析等,而在PPO三級(jí)結(jié)構(gòu)的報(bào)道中,熒光發(fā)射光譜分析用的較多,它是采用熒光分光光度計(jì)進(jìn)行測(cè)定,分析熒光發(fā)射光譜的最大熒光強(qiáng)度及最大熒光發(fā)射峰,通常認(rèn)為掃描得到的最大激發(fā)波長(zhǎng)(285 nm)為酪氨酸和色氨酸的特征吸收峰。

有報(bào)道對(duì)經(jīng)過(guò)超臨界CO2處理和熱處理后的PPO的熒光光譜進(jìn)行分析,經(jīng)熱處理和超臨界CO2處理后的PPO其熒光強(qiáng)度較對(duì)照樣有不同程度的下降,尤其是在35 ℃、35 MPa處理30 min后,熒光強(qiáng)度降到最低值,PPO的三級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生了顯著的變化[59]。劉野等[58]發(fā)現(xiàn)隨著HPCD和超高壓壓強(qiáng)的增大,PPO的熒光強(qiáng)度逐漸增加,表明這兩種處理可以改變芳香族氨基酸周圍的微環(huán)境,使PPO的三級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生變化。在Liu等[21,56]的研究中,先后用DHPM及檸檬酸處理PPO,前者使PPO的相對(duì)熒光強(qiáng)度降低,這可能是由于DHPM使PPO發(fā)生部分去折疊,原本在疏水性環(huán)境中的色氨酸及酪氨酸殘基或多或少地暴露在疏水性較弱的環(huán)境中;后者隨著檸檬酸濃度的增加,PPO的熒光強(qiáng)度逐漸降低,當(dāng)濃度達(dá)到60 mmol/L時(shí),其相對(duì)熒光強(qiáng)度變?yōu)?7.3%,且最大發(fā)射峰從341 nm轉(zhuǎn)移到了344 nm處,發(fā)生了明顯的紅移。Sun等[60]報(bào)道在5 KGy輻照處理1 h后,PPO的活性變?yōu)樵蓟钚缘?%,隨著γ輻射強(qiáng)度(0～10 KGy)的增加,PPO熒光強(qiáng)度依次降低。

3.3 去折疊態(tài)PPO巰基及二硫鍵含量的變化

巰基(-S-H-)和二硫鍵(-S-S-)是蛋白質(zhì)中重要的基團(tuán),具有很高的反應(yīng)活性,常參與酶的催化、輔助因子的結(jié)合以及蛋白質(zhì)分子構(gòu)象的形成,兩者可以相互轉(zhuǎn)換。目前,測(cè)定巰基和二硫鍵含量的方法大都是參照Ellman的方法[61],并進(jìn)行修改。

蛋白質(zhì)中巰基及二硫鍵含量變化的研究雖然比較多,但是關(guān)于PPO中兩者含量變化的報(bào)道較少。壓力誘導(dǎo)的蛋白質(zhì)變性是一個(gè)復(fù)雜的現(xiàn)象,可能是亞基之間的疏水鍵和鹽橋發(fā)生中斷造成的[62]。Yi等[54]發(fā)現(xiàn)靜高壓低于1000 MPa時(shí),蘑菇PPO的巰基含量變化不大,當(dāng)壓力高于1200 MPa時(shí),巰基含量明顯增加,尤其在壓力為1600 MPa時(shí),巰基含量達(dá)到最大,為7.89×10-5M/mg。劉建華[63]研究過(guò)瞬時(shí)高壓作用對(duì)早酥梨梨汁PPO的影響,隨著處理壓力的增大,其相對(duì)活性逐漸上升,巰基含量先增大后降低,壓力為130 MPa時(shí)達(dá)到最大;隨著處理次數(shù)的增加,巰基含量逐漸增大。本課題組還報(bào)道過(guò)未經(jīng)DHPM處理之前,蘑菇PPO的巰基含量為3.3×10-4M/mg,經(jīng)過(guò)處理后,隨著壓力的增加,巰基含量呈現(xiàn)先增后減的趨勢(shì)。PPO的亞基由一系列二硫鍵組成,當(dāng)壓力為130 MPa時(shí),巰基含量達(dá)到最大值,為3.46×10-4M/mg[56]。這可能是由于壓力小于130 MPa時(shí),由于DHPM產(chǎn)生的物理作用,二硫鍵破裂生成新的表面自由巰基,當(dāng)壓力大于130 MPa時(shí),其中一部分巰基可能重組發(fā)生二硫鍵交換反應(yīng)或通過(guò)氧化產(chǎn)生新的二硫鍵[64]。采用其他去折疊方法抑制和鈍化PPO后,其巰基及二硫鍵含量是否會(huì)有變化以及會(huì)有怎樣的變化,這個(gè)問(wèn)題亟待在對(duì)PPO的進(jìn)一步研究中得到解答。

3.4 PPO的去折疊模型

在對(duì)PPO去折疊態(tài)的描述中提到過(guò)蛋白質(zhì)的“二態(tài)模型”以及“三態(tài)模型”,在利用各種手段誘導(dǎo)PPO去折疊的整個(gè)過(guò)程究竟是符合“二態(tài)模型”還是“三態(tài)模型”,該過(guò)程中是否存在折疊中間態(tài),可以通過(guò)相圖法進(jìn)行研究。熒光相圖法是一種根據(jù)蛋白質(zhì)內(nèi)源熒光發(fā)射光譜特定部位的熒光強(qiáng)度作出熒光相圖,進(jìn)而直觀地獲得蛋白質(zhì)去折疊過(guò)程結(jié)構(gòu)變化信息的方法[51],以熒光分光光度計(jì)測(cè)定樣品內(nèi)源熒光發(fā)射譜,扣除對(duì)照體系的內(nèi)源熒光發(fā)射譜后讀取內(nèi)源熒光強(qiáng)度(一般為320 nm和365 nm[52])分別記為I(λ1)、I(λ2),I(λ1)對(duì)I(λ2)作圖則為熒光相圖。若熒光相圖表現(xiàn)為線性,則表示相應(yīng)的去折疊過(guò)程符合“全或無(wú)模型”或“二態(tài)模型”,表示這一蛋白質(zhì)的去折疊過(guò)程無(wú)部分折疊中間態(tài)存在;反之,若表現(xiàn)為非線性,則表示這一蛋白質(zhì)的去折疊過(guò)程是一個(gè)序變過(guò)程,可能存在著一個(gè)或多個(gè)折疊中間態(tài)[65],即“三態(tài)模型”。關(guān)于PPO去折疊模型的研究只有極少數(shù)報(bào)道,在最近的文獻(xiàn)中,Ioni?等[66]在熱誘導(dǎo)引起的酪氨酸酶構(gòu)象變化中提到隨著溫度的升高,酪氨酸酶四聚體結(jié)構(gòu)分裂,在較高溫度下,酶分子存在許多三維結(jié)構(gòu)中間態(tài)(大多為低聚物),且相位圖呈現(xiàn)出非線性結(jié)構(gòu),由此可以判定該去折疊過(guò)程為“三態(tài)模型”。

4 展望

綜上,關(guān)于抑制手段對(duì)PPO活性的影響的研究比較豐富,一方面,大部分的物理處理手段已被研究;另一方面,人們致力于通過(guò)改變化學(xué)抑制劑或?qū)で笮碌奈锢砘瘜W(xué)結(jié)合的方法來(lái)抑制PPO的活性。但是對(duì)于處理之后PPO的分子構(gòu)象變化的研究不是很多,且僅限于PPO的二級(jí)結(jié)構(gòu)、三級(jí)結(jié)構(gòu)等方面,而關(guān)于PPO的活性位點(diǎn)銅離子的變化、構(gòu)象變化與酶促褐變反應(yīng)之間的關(guān)聯(lián)、酶促褐變機(jī)理等還有待進(jìn)一步探討。隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展,現(xiàn)代生化技術(shù)與食品工業(yè)發(fā)展之間的聯(lián)系越來(lái)越緊密,在未來(lái),蛋白質(zhì)組學(xué)、分子模擬、折疊及去折疊動(dòng)力學(xué)等更深層次的研究有望依托日益發(fā)展的科技力量得以實(shí)現(xiàn)更大的突破。

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Research progress in the inhibition of Polyphenoloxidase

XIONG Zhi-qiang,ZHOU Lei,LIU Wei*

(State Key Laboratory of Food Science and Technology,Nanchang University,Nanchang 330047,China)

Polyphenoloxidase(PPO)widely existed in all kinds of organisms,such as botanies,animals,funguses,bacteria and so on. It is also the main reason that leads to enzymatic browning. During food storage and processing,relevant technology are used to inhibit the activity of PPO in order to protect the nutrition,flavor and exterior quality from being damaged in a reasonable time. The inhibition of PPO,the effect of different methods on PPO activity,the research progress in the inhibition kinetics,the conformational changes of unfolded PPO and the unfolding models were summarized. At last,the development of the research was prospected in this review.

Polyphenoloxidase;inhibition;kinetics;conformation;unfolding

2014-12-15

熊志強(qiáng)(1992-)，男，碩士研究生，研究方向：食品加工與保藏，E-mail：xlhtn895311582@139.com。

*通訊作者:劉偉(1972-)，男，博士，教授，研究方向：食品高新技術(shù)與資源綜合利用，E-mail：liuwei@ncu.edu.cn。

國(guó)家自然科學(xué)基金(31460435)；江西省“贛鄱英才555工程”青年拔尖人才培養(yǎng)計(jì)劃。

TS201.1

A

1002-0306(2015)21-0394-07

10.13386/j.issn1002-0306.2015.21.074