多重PCR技術(shù)在食源性致病菌檢測(cè)中應(yīng)用的研究進(jìn)展

李 凡,許恒毅,李福來

(南昌大學(xué) 食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,江西南昌 330047)

多重PCR技術(shù)在食源性致病菌檢測(cè)中應(yīng)用的研究進(jìn)展

李 凡,許恒毅*,李福來

(南昌大學(xué) 食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,江西南昌 330047)

食源性致病菌的多重PCR檢測(cè)技術(shù)是指能夠同時(shí)擴(kuò)增得到同種或多種致病菌的不同基因片段的技術(shù)。因該技術(shù)特異、靈敏且分析效率高,現(xiàn)已被廣泛應(yīng)用于食源性致病菌的檢測(cè)工作中。本文介紹了多重PCR在食源性致病菌檢測(cè)中應(yīng)用的研究近況,并對(duì)影響因素及存在的問題進(jìn)行了闡述。

多重PCR,食源性致病菌,快速檢測(cè),研究進(jìn)展

近年來,國(guó)內(nèi)外食品安全事件頻發(fā),食源性疾病的爆發(fā)率一直居高不下,給人們帶來了巨大的損失和傷害,且引起了各國(guó)政府的廣泛關(guān)注。據(jù)報(bào)道,發(fā)達(dá)國(guó)家每年因不安全食品導(dǎo)致的患病人數(shù)比例高達(dá)30%,僅美國(guó)每年有7600萬人身患食源性疾病,約有5200人死亡[1]。而我國(guó)食源性疾病監(jiān)測(cè)網(wǎng)地區(qū)在2001～2010年統(tǒng)計(jì)到全國(guó)各地食源性疾病暴發(fā)事件共5021起,累計(jì)發(fā)病140101人(含死亡1427人),死亡率為1.019%,其中由食源性致病菌引起的死亡占40.93%[2]。因此,快速檢測(cè)和鑒別食源性致病菌是有效預(yù)防和控制食源性疾病的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。

目前,用于食源性致病菌檢測(cè)的方法主要有傳統(tǒng)培養(yǎng)法、免疫學(xué)方法和分子生物學(xué)方法三類[3],傳統(tǒng)培養(yǎng)法檢測(cè)過程繁瑣、耗時(shí)且工作量大,無法滿足快速檢測(cè)的需要;免疫學(xué)方法由于方法本身的局限性,易發(fā)生交叉反應(yīng)且存在一定程度的漏檢;分子生物學(xué)方法因其操作簡(jiǎn)單、耗時(shí)短、特異性強(qiáng)、靈敏度高等特點(diǎn),已被廣泛應(yīng)用于食源性致病菌的檢測(cè)。其中,最常見用于食源性致病菌檢測(cè)的分子生物學(xué)方法是PCR技術(shù),但常規(guī)PCR方法一次實(shí)驗(yàn)只能檢測(cè)一種病原菌,而食品樣品中往往涉及不同種類和型別的細(xì)菌。多重PCR(mPCR)技術(shù)不僅兼具普通PCR技術(shù)的優(yōu)勢(shì),還可快速地一次性檢測(cè)多種食源性致病菌,提高檢測(cè)效率和準(zhǔn)確性。本文對(duì)多重PCR技術(shù)在食源性致病菌檢測(cè)中應(yīng)用的研究進(jìn)展進(jìn)行了綜述,旨在為基于多重PCR方法檢測(cè)食源性致病菌的研究和建立方法提供參考。

1 多重PCR的原理

多重PCR是指在同一反應(yīng)體系中加入兩對(duì)或兩對(duì)以上特異性引物擴(kuò)增出多個(gè)目的片段的方法。其原理如圖1所示,在模板DNA、dNTP、適當(dāng)緩沖液以及特異性引物存在下,依賴于DNA聚合酶的催化,使多對(duì)特異性引物所界定的DNA片段進(jìn)行擴(kuò)增。由于多重PCR可在同一個(gè)反應(yīng)體系中同時(shí)檢測(cè)多個(gè)基因,節(jié)約了檢測(cè)時(shí)間和成本,是一種既高效又經(jīng)濟(jì)的食源性致病菌檢測(cè)技術(shù)。

圖1 多重PCR原理圖Fig.1 The schematic diagram of multiplex PCR

2 多重PCR在食源性致病菌檢測(cè)中應(yīng)用的研究進(jìn)展

在檢測(cè)食源性致病菌時(shí),多重PCR擴(kuò)增的靶基因主要為16S rRNA、菌株相關(guān)的特異性基因、毒力相關(guān)基因等三類。用于食源性致病菌屬間檢測(cè)的靶基因一般為較保守的16S rRNA,用于食源性致病菌屬內(nèi)種間檢測(cè)的靶基因一般為種特異性基因。應(yīng)用多重PCR檢測(cè)食源性致病菌的關(guān)鍵是根據(jù)靶基因合理地設(shè)計(jì)引物。

2.1 用于檢測(cè)單一食源性致病菌

對(duì)于具有復(fù)雜血清型的致病菌如大腸桿菌和沙門氏菌,采用傳統(tǒng)PCR方法檢測(cè)特異性差,易造成錯(cuò)判。多重PCR方法相比普通PCR方法可以同時(shí)考察多個(gè)菌株特征,具有更高的特異性。O157∶H7是致病性大腸桿菌的主要血清型,Bai等[4]根據(jù)大腸桿菌O157∶H7的特異性基因fliC、stx1、stx2、eae、rfbE和hlyA建立多重PCR方法,對(duì)221株產(chǎn)志賀毒素大腸桿菌進(jìn)行檢測(cè),結(jié)果所有大腸桿菌O157均特異性地?cái)U(kuò)增出6條片段,經(jīng)過6 h富集培養(yǎng)后檢測(cè)限達(dá)到10 CFU/g。Gordillo等[5]采用多重PCR方法同時(shí)檢測(cè)大腸桿菌O157∶H7中編碼O157抗原的rfbE和編碼H7鞭毛抗原的fliCh7,設(shè)計(jì)了2對(duì)引物,在供試的14株參考菌株中,僅2株為陽性結(jié)果,其余均為陰性,有效地防止了錯(cuò)檢,提高了結(jié)果的準(zhǔn)確性。Lim等[6]選擇鼠傷寒沙門氏菌中編碼O4抗原的rfbJ、編碼H:i抗原的fliC和編碼H:1,2抗原的fljB為目的基因,設(shè)計(jì)了3對(duì)引物,應(yīng)用多重PCR進(jìn)行檢測(cè),在供試的32株已知菌株中,3株鼠傷寒沙門氏菌均擴(kuò)增出663、183和526bp的3條片段,表現(xiàn)出較高的特異性。Trafny等[7]根據(jù)沙門氏菌的hilA、spvA和invA,腸炎沙門氏菌的sdf以及16S rRNA設(shè)計(jì)了5對(duì)引物,應(yīng)用多重PCR對(duì)糞便進(jìn)行檢測(cè),可特異性地檢出腸炎沙門氏菌。

對(duì)于具有較多毒力基因的致病菌如金黃色葡萄球菌,采用多重PCR方法對(duì)致病菌中多個(gè)毒力相關(guān)基因進(jìn)行同時(shí)檢測(cè),不僅可以檢出致病菌,還可了解致病菌含毒力相關(guān)基因的數(shù)量及致病性的強(qiáng)弱。Nagaraj等[8]根據(jù)金黃色葡萄球菌的5種毒力相關(guān)基因(sea、seb、sec、seg和sei)、TSST-1編碼基因(tst)、甲氧西林耐藥性基因(mecA)、以及凝固酶相關(guān)基因(coa)設(shè)計(jì)合適的引物,建立多重PCR方法,并設(shè)置內(nèi)標(biāo)以排除假陰性結(jié)果。在供試的91株金黃色葡萄球菌中,內(nèi)標(biāo)均為陽性,擴(kuò)增出sea、seb、sec、seg、sei、tst、mecA以及coa的比率分別為36.26%、28.57%、61.53%、59.34%、58.24%、3.29%、27.47%、95.60%,結(jié)果證明絕大部分金黃色葡萄球菌攜帶兩種或兩種以上的毒力相關(guān)基因。Ertas等[9]采用多重PCR方法對(duì)150份甜點(diǎn)和干酪樣品進(jìn)行檢測(cè),先根據(jù)生化實(shí)驗(yàn)確定含有凝固酶陽性葡萄球菌(CPS)的樣品,再根據(jù)CPS的sea、seb、sec和sed四種腸毒素相關(guān)基因設(shè)計(jì)引物,進(jìn)而了解CPS中的四種腸毒素相關(guān)基因存在狀況。

2.2 用于檢測(cè)屬內(nèi)種間的食源性致病菌

對(duì)于同一屬內(nèi)的食源性致病菌,應(yīng)用多重PCR方法進(jìn)行檢測(cè)不僅可提高結(jié)果的準(zhǔn)確率,還可快速地一次性檢測(cè)屬內(nèi)多種食源性致病菌,提高檢測(cè)效率。Wei等[10]根據(jù)弧菌屬的16S rRNA保守序列以及種特異性基因gyrB(溶藻弧菌)、collagenase(副溶血性弧菌)、vvhA(創(chuàng)傷弧菌)、ompW(霍亂弧菌)設(shè)計(jì)了五對(duì)引物,建立多重PCR方法,可同時(shí)檢出上述4種致病菌,縮短了檢測(cè)時(shí)間,大大地提高了檢測(cè)效率。同時(shí)利用弧菌屬16S rRNA序列極為保守穩(wěn)定的特點(diǎn)將其作為內(nèi)標(biāo)進(jìn)行屬的鑒別,保證了檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確率。Ryu等[11]選擇李斯特菌屬的屬特異性基因prs以及l(fā)mo1030(單核細(xì)胞增生李斯特氏菌)、Oxidoreductase(格氏李斯特氏菌)、lin0464(無害李斯特菌)、namA(伊氏李斯特菌)、scrA(威氏李斯特菌)、lmo0333(斯氏李斯特菌)設(shè)計(jì)了七對(duì)引物,應(yīng)用多重PCR對(duì)肉制品中分離出的93株李斯特菌進(jìn)行檢測(cè),結(jié)果發(fā)現(xiàn)有81株為單核細(xì)胞增生李斯特氏菌、10株為無害李斯特菌、2株為威氏李斯特菌。該方法利用李斯特菌屬的prs作為內(nèi)標(biāo),以指示檢測(cè)中出現(xiàn)的假陰性,提高檢測(cè)的準(zhǔn)確率。同時(shí)可檢測(cè)多種菌,與普通PCR方法相比,具有更高的檢測(cè)效率。

對(duì)于培養(yǎng)條件較為嚴(yán)格的致病菌如彎曲桿菌屬,多重PCR方法可彌補(bǔ)傳統(tǒng)培養(yǎng)法難于操作的不足。Amri等[12]選擇彎曲桿菌屬的cadF以及hipO(耶爾森彎曲桿菌)、asp(大腸彎曲桿菌)建立多重PCR方法,靈敏度都達(dá)到15～16 ng DNA/mL,各反應(yīng)體系組分間未發(fā)生任何交叉反應(yīng)。而對(duì)74株彎曲桿菌屬進(jìn)行馬尿酸鹽水解驗(yàn)證實(shí)驗(yàn),結(jié)果有17株菌表現(xiàn)為假陽性和7株菌表現(xiàn)為假陰性。

2.3 用于檢測(cè)不同屬的食源性致病菌

多重PCR可同時(shí)對(duì)不同屬的食源性致病菌進(jìn)行檢測(cè)和分析,快速確定食品中是否存在某種致病菌,相對(duì)于上述兩種檢測(cè),具有更高的檢測(cè)效率和實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。大多數(shù)食源性致病菌1～10 CFU劑量即可致病,對(duì)于含目的菌數(shù)量少或者存在復(fù)雜干擾性成分的常規(guī)食品,直接用PCR方法檢測(cè)靈敏度低且特異性差,一般前期需要對(duì)目的菌進(jìn)行預(yù)增菌或高效分離富集。Chiang等[13]應(yīng)用多重PCR方法同時(shí)檢測(cè)牛奶和肉制品中的單增李斯特菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌O157∶H7等多種致病菌,直接檢測(cè)其靈敏度為103～104CFU/mL,而在TSB中經(jīng)過8 h富集培養(yǎng)后,其靈敏度可達(dá)1 CFU/mL。Lee等[14]報(bào)道了多重PCR方法在同一反應(yīng)體系中檢測(cè)大腸桿菌O157∶H7、蠟樣芽孢桿菌、副溶血性弧菌、沙門氏菌、單核細(xì)胞增生李斯特氏菌、金黃色葡萄球菌的方法,在對(duì)食品的模擬檢測(cè)中,細(xì)菌經(jīng)過12 h的富集,靈敏度都達(dá)到1 CFU/mL,縮短了檢測(cè)時(shí)間并節(jié)省了成本,有效地提高了檢測(cè)效率。Guan等[15]根據(jù)invA(沙門氏菌)、nuc(金黃色葡萄球菌)、hlyA(單核細(xì)胞增生李斯特氏菌)、ail(小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌)和rfbE(大腸桿菌O157∶H7)設(shè)計(jì)了5對(duì)引物,建立多重PCR方法,在豬肉模擬檢測(cè)中,經(jīng)過夜富集培養(yǎng)后,可同時(shí)檢測(cè)出上述5種菌,檢測(cè)限都達(dá)到103CFU/mL。Garrido等[16]采用多重?zé)晒舛縋CR方法檢測(cè)食品中的沙門氏菌和單增李斯特菌,用改良過的TA10選擇培養(yǎng)基進(jìn)行富集培養(yǎng),檢測(cè)限都達(dá)5 CFU/25g。為了縮短檢測(cè)時(shí)間,同時(shí)清除食品基質(zhì)中的干擾物,Ma等[17]將多重?zé)晒舛縋CR方法與免疫磁分離技術(shù)結(jié)合,檢測(cè)鮮肉制品中的沙門氏菌、志賀氏桿菌及金黃色葡萄球菌,能將靈敏度降至沙門氏菌2.0 CFU/g、志賀氏桿菌6.8 CFU/g、金黃色葡萄球菌9.6 CFU/g,有效地避免了實(shí)際樣品中相關(guān)致病菌的漏檢。同時(shí)該方法簡(jiǎn)化了樣品富集步驟,縮短了檢測(cè)時(shí)間(≤8 h),大大提高了檢測(cè)效率。

此外,將多重PCR與其他技術(shù)結(jié)合在同時(shí)檢測(cè)不同屬的食源性致病菌中也有不少應(yīng)用。Chiang等[18]結(jié)合多重PCR方法和基因芯片技術(shù),檢測(cè)牛奶和肉制品中的單核細(xì)胞增生李斯特氏菌、金黃色葡萄球菌、阪崎腸桿菌、沙門氏菌、大腸桿菌O157∶H7、無乳鏈球菌、副溶血性弧菌和熒光假單胞菌共8種致病菌,直接檢測(cè)靈敏度為103～104CFU/mL,在TSB中經(jīng)過8 h富集,靈敏度達(dá)到1 CFU/mL。Morin等[19]根據(jù)rfbE和fliC(大腸桿菌O157∶H7)、rfbE(霍亂弧菌)及tyv(傷寒沙門氏菌)設(shè)計(jì)了四對(duì)引物,建立多重反轉(zhuǎn)錄PCR方法,提取致病菌的mRNA,將其反轉(zhuǎn)錄成cDNAs后再進(jìn)行PCR擴(kuò)增,可同時(shí)檢測(cè)上述三種致病菌。由于mRNA只存在于活細(xì)菌中,避免了死菌中DNA對(duì)PCR擴(kuò)增的干擾。Yang等[20]對(duì)食品中的鼠傷寒沙門氏菌、大腸桿菌O157∶H7和單核細(xì)胞增生李斯特氏菌進(jìn)行檢測(cè)時(shí),用免疫磁珠捕獲目的菌后,采用疊氮溴化丙錠(PMA)對(duì)目的菌進(jìn)行處理,由于PMA完全不能通透細(xì)胞膜,只能選擇性的修飾死菌“暴露”的DNA(細(xì)胞壁和細(xì)胞膜已破損的細(xì)菌),形成共價(jià)氮碳鍵,抑制死菌DNA在PCR時(shí)的擴(kuò)增,提高了多重PCR檢測(cè)活菌的準(zhǔn)確率。同時(shí)該方法不需要經(jīng)過富集處理,整個(gè)檢測(cè)過程僅需4.5 h,且靈敏度高,有效地提高了檢測(cè)效率。

3 影響多重PCR的因素

多重PCR在同一反應(yīng)體系中對(duì)多個(gè)DNA片段進(jìn)行特異性擴(kuò)增,反應(yīng)體系較為復(fù)雜,影響擴(kuò)增效果的因素較多,大體可分為反應(yīng)體系和反應(yīng)條件兩大類。其中,反應(yīng)體系主要包括引物、TaqDNA聚合酶、dNTP和MgCl2等,反應(yīng)條件主要包括退火溫度和循環(huán)數(shù)等[21]。引物設(shè)計(jì)則是實(shí)驗(yàn)成敗的關(guān)鍵,直接影響多重PCR的特異性和靈敏度。引物設(shè)計(jì)不當(dāng)各引物間極易形成引物二聚體或產(chǎn)生非特異性擴(kuò)增產(chǎn)物[22],不僅消耗反應(yīng)體系中的各組分,而且還影響退火與延伸的速率。引物設(shè)計(jì)時(shí)應(yīng)特別注意目標(biāo)序列的同源性引物、長(zhǎng)度、GC含量、濃度等因素,還應(yīng)注意各引物對(duì)間的最適退火溫度盡可能相同且無任何交互作用等。TaqDNA聚合酶用于催化反應(yīng),由于多重PCR中存在多個(gè)DNA片段的擴(kuò)增反應(yīng),各反應(yīng)間會(huì)不同程度地競(jìng)爭(zhēng)TaqDNA聚合酶,若TaqDNA聚合酶使用量過低會(huì)抑制競(jìng)爭(zhēng)效率低的DNA擴(kuò)增,過多則會(huì)導(dǎo)致非特異性擴(kuò)增[23]。dNTP和MgCl2二者具有相關(guān)性,在反應(yīng)體系中兩者應(yīng)保持平衡。退火溫度取決于引物的長(zhǎng)度、堿基的組成和目的片段的長(zhǎng)度,決定反應(yīng)的特異性與產(chǎn)量。在實(shí)驗(yàn)過程中,應(yīng)綜合考慮各個(gè)解鏈溫度(Tm),在Tm值允許范圍內(nèi),選擇較高的退火溫度以減少引物和模板間的非特異性結(jié)合,確保PCR反應(yīng)的特異性[24]。循環(huán)數(shù)取決于反應(yīng)體系中起始的模板拷貝數(shù)以及引物延伸和擴(kuò)增的速率,一般含105個(gè)拷貝的靶序列的反應(yīng)體系在TaqDNA聚合酶的催化下進(jìn)行30個(gè)循環(huán)就能夠有效地?cái)U(kuò)增目的片段。

4 結(jié)語

多重PCR具有高特異性、高靈敏度、高效率和低成本等優(yōu)點(diǎn),目前已廣泛應(yīng)用于食源性致病菌的檢測(cè)。但在實(shí)際應(yīng)用中還應(yīng)特別注意以下問題:1)食品中存在的復(fù)雜抑制因子干擾PCR擴(kuò)增;2)較易形成引物二聚體和非特異性擴(kuò)增;3)較難區(qū)別活菌和死菌。因此,未來的研究主要集中在對(duì)樣品前處理技術(shù)進(jìn)行改進(jìn),去除抑制因子的干擾,同時(shí)不斷優(yōu)化多重PCR的反應(yīng)體系和反應(yīng)條件,并與其他技術(shù)結(jié)合如多重逆轉(zhuǎn)錄PCR[19,25]、多重?zé)晒舛縋CR[16,26]、多重PCR基因芯片技術(shù)[18,27]等,以及加入核酸交聯(lián)劑如疊氮溴化丙錠(PMA)、疊氮溴化乙錠(EMA)等抑制死菌DNA的擴(kuò)增用于區(qū)別活菌和死菌[28],提高反應(yīng)的靈敏度和特異性。隨著分子生物學(xué)檢測(cè)理論和技術(shù)的不斷發(fā)展與完善,多重PCR必將在檢測(cè)食源性致病菌方面具有更好的應(yīng)用前景。

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Application of multiplex polymerase chain reaction in detection of foodborne pathogens

LI Fan,XU Heng-yi*,LI Fu-lai

(State Key Laboratory of Food Science and Technology,Nanchang University,Nanchang 330047,China)

Multiplex polymerase chain reaction(mPCR)for detection of foodborne pathogens is a kind of detection technique which can simultaneously amplify multiple gene fragments of the one pathogen or different pathogens. Due to these advantages of high specificity,sensitivity and efficiency,mPCR is widely used for the detection of foodborne pathogens. In this article,the applications of mPCR in the detection of foodborne pathogens during the past 10 years are reviewed,and the influence factors or problems of mPCR are discussed.

multiplex polymerase chain reaction;foodborne pathogen;detection;research progress

2015-01-12

李凡(1990-)，女，碩士研究生，研究方向：食品安全與檢測(cè)，E-mail：349465359@qq.com。

*通訊作者:許恒毅(1981-)，男，博士，副研究員，研究方向：食品生物技術(shù)，E-mail：kidyxu@163.com。

江西省青年科學(xué)家(井岡之星)培養(yǎng)對(duì)象項(xiàng)目(20142BCB23004)；“十二五”國(guó)家科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目(2011BAK10B06)。

TS207.4

A

1002-0306(2015)21-0372-04

10.13386/j.issn1002-0306.2015.21.069