輔酶Q10前體脂質(zhì)體的制備及其質(zhì)量評(píng)價(jià)

隋小宇,董曉澤,韓翠艷,袁 橙,劉 暢,馬曉星,劉婷婷

(齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院,黑龍江齊齊哈爾 161006)

輔酶Q10前體脂質(zhì)體的制備及其質(zhì)量評(píng)價(jià)

隋小宇,董曉澤,韓翠艷,袁 橙,劉 暢,馬曉星,劉婷婷*

(齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院,黑龍江齊齊哈爾 161006)

Flavor of Lamb[J]. J Agric Food Chem,1963,11(4):336-339.

[16]李偉,羅瑞明,李亞蕾，等. 寧夏灘羊的特征香氣成分分析[J].現(xiàn)代食品科技,2013,29(5):1173-1177.

[17]郭麗,蔡良綏,林智,等.基于主成分分析法的白茶香氣質(zhì)量評(píng)價(jià)模型構(gòu)建[J].熱帶作物學(xué)報(bào),2010,31(9):1606-1610.

采用高壓均質(zhì)結(jié)合冷凍干燥法制備輔酶Q10前體脂質(zhì)體,并通過(guò)正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)對(duì)處方及工藝進(jìn)行優(yōu)化。經(jīng)紅外光譜、X射線衍射等手段對(duì)優(yōu)化后的產(chǎn)品質(zhì)量進(jìn)行分析,同時(shí),對(duì)其穩(wěn)定性進(jìn)行評(píng)價(jià)。結(jié)果顯示本研究制備的輔酶Q10前體脂質(zhì)體經(jīng)重建后的平均粒徑為241 nm,包封率67.31%,貯存90 d后質(zhì)量無(wú)明顯變化。本實(shí)驗(yàn)制備的前體脂質(zhì)體,質(zhì)量可靠,穩(wěn)定性好,工藝便捷,適于工業(yè)生產(chǎn)及食品中應(yīng)用。

輔酶Q10,前體脂質(zhì)體,冷凍干燥,正交設(shè)計(jì)

輔酶Q10(coenzyme Q10)是人體中一種內(nèi)源性抗氧化劑,也是細(xì)胞代謝激活劑,其富含于心臟、肝臟和大腦中[1]。但是隨著年齡的增長(zhǎng),人體合成輔酶Q10的能力逐漸降低[2],因此外源性輔酶Q10的補(bǔ)充很有必要,美國(guó)FDA在上世紀(jì)80年代就已批準(zhǔn)輔酶Q10可作為膳食補(bǔ)充劑[3]。但由于輔酶Q10分子量較大,且在水中溶解度極低,因此口服吸收效率差[4]。

脂質(zhì)體具有良好的生物相容性、可降解性及靶向性,并且克服了疏水性物質(zhì)胃腸吸收差的問(wèn)題,因此在食品和藥品領(lǐng)域有著廣闊的應(yīng)用前景。但其貯存過(guò)程中具有易水解、聚集、分層、包封物滲漏等缺點(diǎn),因此,對(duì)其應(yīng)用產(chǎn)生了一定的限制[5]。

前體脂質(zhì)體系脂質(zhì)體的前體形式,通常為干燥且具有良好流動(dòng)性能的粉末,在水中可自發(fā)形成完整的脂質(zhì)體。它具有脂質(zhì)體制劑的一系列作用特點(diǎn),又可解決其易水解、聚集、分層、藥物滲漏和高溫滅菌不穩(wěn)定等問(wèn)題,這為脂質(zhì)體在提高食品活性物的生物利用度和應(yīng)用提供了一個(gè)有效的途徑[6]。但前體脂質(zhì)體商品化進(jìn)程至今仍較緩慢,主要原因是前體脂質(zhì)體的質(zhì)量不易控制,尤其是重建后的粒徑尺寸和包封率不穩(wěn)定,而脂質(zhì)體粒徑的大小直接影響其在體內(nèi)的吸收和分布,已有研究表明,脂質(zhì)體粒徑越小其靶向性越優(yōu)良[7]。

目前,粉末狀脂質(zhì)體前體的制備主要有載體沉積法及將傳統(tǒng)脂質(zhì)體制備方法同冷凍干燥或噴霧干燥相結(jié)合的方法。但這些方法存在產(chǎn)品粒徑大,粒徑分布不均,載體受熱不穩(wěn)定,產(chǎn)品不易收集等缺點(diǎn)。基于此,本研究擬采用高壓均質(zhì)法(擠壓法)結(jié)合冷凍干燥法制備輔酶Q10前體脂質(zhì)體,并對(duì)其處方和工藝進(jìn)行優(yōu)化,以解決其重建后粒徑較大及分布較寬的問(wèn)題。同時(shí),該方法避免了高溫對(duì)主藥及載體的影響,且產(chǎn)品易于收集。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

RE-52AA型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海青浦滬西儀器廠;Scientz-10N型真空冷凍干燥機(jī) 寧波新芝生物科技股份有限公司;NS1001L 高壓均質(zhì)機(jī) 意大利 GEA Niro Soavi公司;Biofuge 22R型低溫高速離心機(jī) 德國(guó)Heraeus公司;高效液相色譜儀(Waters 1525型進(jìn)樣泵+Waters 2489型紫外/可見(jiàn)檢測(cè)器) 美國(guó)Waters公司;IRAffinity-1型紅外光譜儀 日本島津公司;Xpert-Pro型X射線衍射儀 荷蘭Philips公司;BI-90Plus型激光粒度儀 美國(guó)Brookhaven公司;大豆卵磷脂S100(平均分子量734.83 g/mol)、蛋黃卵磷脂E80(平均分子量648.22 g·mol-1) 均購(gòu)自德國(guó)LIPOID公司;膽固醇 上海艾韋特醫(yī)藥科技有限公司;輔酶Q10(≥98%) 購(gòu)自陜西森弗生物技術(shù)有限公司;輔酶Q10對(duì)照品 購(gòu)自美國(guó)Sigma公司;甲醇(色譜純) 美國(guó)Merck公司;乙醇、丙酮、二氯甲烷均為分析純;所有用水均為超純水,自制。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 輔酶Q10前體脂質(zhì)體的制備 精確稱取配方量的輔酶Q10、卵磷脂、膽固醇溶解于5 mL有機(jī)溶劑,然后將該有機(jī)溶劑與一定體積比的PBS緩沖液(pH7.4)混合,使用溫控磁力攪拌器于2000 r·min-1轉(zhuǎn)速下攪拌一定時(shí)間(5、10、20 min)后形成乳化液。將該乳化液置于100 mL梨形燒瓶中減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)揮盡有機(jī)溶劑,得到脂質(zhì)體混懸液。將此混懸液在一定壓力(40、60、80 MPa)下高壓均質(zhì)擠壓處理(6個(gè)循環(huán)),即制得較均勻的淡黃色的輔酶Q10脂質(zhì)體懸浮液。最后將該懸浮液加入凍干保護(hù)劑,于-40 ℃冰箱中預(yù)凍3 h后,置于冷凍干燥機(jī)中干燥后即得到輔酶Q10前體脂質(zhì)體。

1.2.2 卵磷脂及有機(jī)溶劑的選擇 分別稱取70 μmol所對(duì)應(yīng)質(zhì)量的大豆卵磷脂及蛋黃卵磷脂,并分別與35 μmol膽固醇及4.5 mg輔酶Q10共同溶解于5 mL二氯甲烷或氯仿中,與25 mL的PBS緩沖溶液混合,于35 ℃溫度下攪拌5 min形成乳化液(攪拌速度為2000 r·min-1),然后于40 ℃下減壓蒸發(fā)3 h除去有機(jī)相,脂質(zhì)體混懸液于30 MPa下進(jìn)行高壓均質(zhì)處理,最后將脂質(zhì)體混懸液置于-40 ℃冰箱中預(yù)凍3 h后,放入凍干機(jī)中冷凍干燥處理后得到前體脂質(zhì)體。將使用兩種卵磷脂所制得的前體脂質(zhì)體,分別在室溫下水化重建40 min,比較脂質(zhì)體重建液的包封率及平均粒徑。

1.2.3 處方篩選 本研究以輔酶Q10包封率和重建脂質(zhì)體的平均粒徑為主要考察指標(biāo),保持工藝條件不變(乳化攪拌時(shí)間10 min,乳化溫度35 ℃,減壓蒸發(fā)溫度40 ℃,減壓蒸發(fā)時(shí)間3 h,旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)轉(zhuǎn)速75～85 r·min-1,均質(zhì)壓力40 MPa,凍干保護(hù)劑甘露醇與卵磷脂質(zhì)量比為1∶1)。通過(guò)預(yù)實(shí)驗(yàn),選擇了四種影響因素:磷脂與膽固醇的質(zhì)量比(A)、卵磷脂用量(B)、磷脂與輔酶Q10的質(zhì)量比(C)、有機(jī)相與水相的體積比(D),每個(gè)因素取三水平選用L9(34)正交表進(jìn)行處方正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì),實(shí)驗(yàn)因素與水平見(jiàn)表1。

表1 配方篩選正交設(shè)計(jì)因素水平表

1.2.4 制備工藝優(yōu)化 本研究固定處方(卵磷脂用量100 mg,卵磷脂與膽固醇質(zhì)量比4∶1,磷脂與輔酶Q10的質(zhì)量比10∶1,有機(jī)相與水相之比為1∶4,凍干保護(hù)劑甘露醇與卵磷脂質(zhì)量比為1∶1),根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果選擇了三個(gè)主要因素:均質(zhì)壓力(A)、減壓蒸發(fā)溫度(B)、乳化攪拌時(shí)間(C),每個(gè)因素取三水平選用L9(34)正交表進(jìn)行制備工藝正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì),實(shí)驗(yàn)因素與水平見(jiàn)表2。

表2 優(yōu)化制備工藝的正交設(shè)計(jì)因素水平表

1.2.5 凍干保護(hù)劑的選擇 本實(shí)驗(yàn)中,稱取960 mg大豆卵磷脂、240 mg膽固醇、96 mg輔酶Q10共同溶解于60 mL二氯甲烷中,然后與360 mL的PBS緩沖液于35 ℃下混合攪拌5 min,將此乳化液于45 ℃下減壓蒸發(fā)3 h除去二氯甲烷,將該懸浮液高壓均質(zhì)(60 MPa)處理6個(gè)循環(huán)后分成等量若干份,分別加入不同質(zhì)量的海藻糖、葡萄糖和甘露醇作為凍干保護(hù)劑,冷凍干燥后水化重建,檢測(cè)包封率及平均粒徑尺寸,對(duì)比其凍干保護(hù)效果。

1.2.6 重建脂質(zhì)體溶液的沉降穩(wěn)定性 取3批前體脂質(zhì)體,用注射用水重建水合(2.5 mg·mL-1),將其置于4 ℃冰箱內(nèi),于每天同一時(shí)間觀察其沉淀現(xiàn)象。

表3 不同卵磷脂及有機(jī)溶劑對(duì)產(chǎn)品包封率及平均粒徑的影響

1.2.7 前體脂質(zhì)體貯存穩(wěn)定性的考察 取3批前體脂質(zhì)體置于-20 ℃下貯存,并于不同時(shí)間點(diǎn)(0、30、60、90 d)取樣,進(jìn)行平均粒度及包封率的檢測(cè)。

1.2.8 各項(xiàng)指標(biāo)檢測(cè)

1.2.8.1 粒徑的測(cè)定 稱取10 mg前體脂質(zhì)體樣品加入4 mL去離子水中,于室溫(25 ℃左右)下水化重建40 min后,取3 mL加入比色皿,不加入表面活性劑,移入激光粒度分析儀樣品池。檢測(cè)溫度設(shè)定為25 ℃。單次時(shí)間1.5 min,測(cè)定3次。

1.2.8.2 HPLC測(cè)定方法的建立 采用高效液相色譜法(HPLC)對(duì)輔酶Q10含量進(jìn)行測(cè)定。色譜柱:Hypersil C18柱(φ4.6 mm×250 mm,5μm);流動(dòng)相:甲醇-乙醇(10∶90體積比);流速:1.0 mL·min-1;進(jìn)樣量:10 μL;檢測(cè)波長(zhǎng):275 nm;柱溫:25 ℃。

精確稱取10 mg輔酶Q10標(biāo)準(zhǔn)品,用正己烷-乙醇混合溶劑(體積比1∶1)溶解定容至10 mL。然后分別移取100、250、500、1000、2500、5000 μL至10 mL容量瓶,用混合溶劑定容,配制成濃度為10、25、50、100、250、500 μg·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)溶液。

以峰面積(y)和樣品的質(zhì)量濃度(x)為縱、橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸,求得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程:y=20439x-19689,R2=0.999,線性范圍為10～500 μg/mL。方法的精密度、重現(xiàn)性的RSD值分別為0.28%和0.55%;回收率為98.85%,RSD值為0.98%,符合限度要求。

1.2.8.3 包封率的測(cè)定方法 在本研究中,采用反透析法測(cè)定脂質(zhì)體包封率。移取前體脂質(zhì)體重建液50 mL置于透析袋外,水合介質(zhì)2 mL于透析袋內(nèi),攪拌透析袋外液,透析12 h。精密吸取透析袋內(nèi)液,以2 mL正己烷萃取后,使用正己烷-乙醇(1∶1 v/v)混合溶劑定容至10 mL,并采用HPLC法測(cè)定其濃度,經(jīng)換算后計(jì)算出50 mL重建液中游離藥物含量。另取未透析的脂質(zhì)體溶液5 mL,加入5 mL乙醇,超聲處理5 min破乳后,再加入10 mL丙酮,渦旋震蕩1 min,然后取10 mL置于離心機(jī)中以8000 r/min的轉(zhuǎn)速離心10 min,取上清液采用HPLC法檢測(cè)其中輔酶Q10的含量,經(jīng)換算后計(jì)算出50 mL重建液中主藥總含量。按下式計(jì)算包封率:

包封率(%)=[1-(游離輔酶Q10含量/輔酶Q10總含量)]×100

1.2.8.4 紅外光譜分析 分別稱取2～3 mg樣品與200 mg溴化鉀,使用瑪瑙研缽研磨混合均勻后壓片待測(cè)。紅外光譜掃描范圍為400～4000 cm-1。

1.2.8.5 X射線衍射分析 樣品檢測(cè)電壓40 kV,電流30mA,掃描范圍從3°到30°,掃描速率為1°·min-1。

2 結(jié)果與分析

2.1 有機(jī)溶劑及磷脂種類的確定

實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表3所示。從包封率來(lái)看,當(dāng)使用蛋黃卵磷脂,并且以氯仿為溶劑時(shí),水合后的前體脂質(zhì)體包封率最高,達(dá)到了60.82%。當(dāng)使用大豆卵磷脂,并且使用氯仿為溶劑時(shí),重建后的脂質(zhì)體包封率最低,為31.59%。而同時(shí)使用大豆卵磷脂及二氯甲烷時(shí),包封率為52.55%,與同時(shí)選擇蛋黃卵磷脂及氯仿時(shí),相差了8.27%。另一方面,對(duì)于制備過(guò)程來(lái)講,當(dāng)以二氯甲烷為溶劑時(shí),由于二氯甲烷沸點(diǎn)比氯仿低,所以減壓蒸發(fā)時(shí)只需控制較低的溫度,溶劑即可快速揮盡,而氯仿則需要更高的溫度和更長(zhǎng)的時(shí)間才能徹底揮盡,從能耗和效率上考慮,二氯甲烷更加適宜。并且,從乳化的效果來(lái)看,二氯甲烷與PBS緩沖溶液的乳化效果優(yōu)于氯仿,混合乳化更加容易且乳化液更加均勻,而氯仿與水的乳化效果一般。另外,從溶劑的安全性角度考慮,由于二氯甲烷為低毒溶劑,而氯仿為中等毒性溶劑,所以,使用二氯甲烷更為適宜。

從重建液平均粒徑來(lái)看,無(wú)論是使用二氯甲烷還是氯仿,大豆卵磷脂體系重建液的平均粒徑都要比蛋黃卵磷脂體系的粒徑小。綜合考慮粒徑,包封率及安全性,最終選擇使用大豆卵磷脂為膜材,二氯甲烷為溶解溶劑。

2.2 處方篩選正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

處方篩選的正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果列于表4。在本研究中,采用雙指標(biāo)進(jìn)行優(yōu)化,由于未對(duì)兩指標(biāo)的權(quán)重系數(shù)進(jìn)行評(píng)分,所以,為了盡量避免雙指標(biāo)在因素及水平篩選的過(guò)程中出現(xiàn)不一致,我們主要對(duì)具有顯著影響(p<0.05)的因素進(jìn)行水平優(yōu)化,而其它無(wú)顯著影響的因素(p>0.05),在選擇水平時(shí)會(huì)適當(dāng)考慮成本和能耗。對(duì)于包封率,由極差值對(duì)比可知,各因素影響大小次序?yàn)镃>A>B>D,即脂藥比>脂膽比>卵磷脂用量>有機(jī)相與水相體積比。為了進(jìn)一步確認(rèn)影響因素的顯著性,進(jìn)行方差分析,由于樣本量較少,自由度不足,無(wú)法進(jìn)行4因素的方差分析,所以,將極差分析中影響最小的D因素舍去,對(duì)其他因素進(jìn)行正交的方差分析。結(jié)果表明,A、B、C三因素的p值分別為0.025、0.093和0.024,說(shuō)明因素A及C對(duì)包封率的影響具有顯著性(p<0.05)。對(duì)于因素A具有顯著性的機(jī)理可能在于:膽固醇作為兩親性物質(zhì),可以起到表面活性劑的作用,能調(diào)節(jié)脂質(zhì)體膜的流動(dòng)性,增加藥物與磷脂親合性,防止藥物的滲漏。膽固醇也能在脂質(zhì)體表面形成一層電荷層,增加脂質(zhì)體微粒間的斥力,避免脂質(zhì)體融合,發(fā)揮穩(wěn)定脂質(zhì)體的作用[8-9],這也就有效提高了藥物的包封率。對(duì)于平均粒徑,極差分析結(jié)果顯示四種因素的影響大小次序?yàn)镃>A>B>D。同樣舍去因素D進(jìn)行方差分析,A、B、C三因素的p值分別為0.215、0.590和0.143,說(shuō)明三種因素對(duì)粒徑的影響均不顯著。因此,首先將對(duì)于包封率具有顯著影響的因素A和C進(jìn)行水平選擇,根據(jù)極值確定A1C2組合,其次考慮到因素B水平過(guò)低及因素D水平過(guò)高時(shí),獲得單位質(zhì)量產(chǎn)品的凍干成本均將增加,所以選擇B2及C2水平,最終組合為A1B2C2D2。在此條件制備的前體脂質(zhì)體,其重建液的包封率為61.31%,平均粒徑為286 nm。

表4 輔酶Q10前體脂質(zhì)體配方篩選正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.3 制備工藝的正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表5。對(duì)于包封率,極差分析顯示三種因素影響大小次序?yàn)锽>A>C。通過(guò)進(jìn)一步的方差分析可知,A、B、C三因素的p值分別為0.087、0.028和0.899,說(shuō)明因素B對(duì)包封率具有顯著影響,而其它兩因素對(duì)包封率無(wú)顯著影響。因素B具有顯著影響可能是由于在有機(jī)溶劑的減壓蒸發(fā)過(guò)程中,溫度可以影響卵磷脂膜的流體性質(zhì),繼而影響脂質(zhì)體的構(gòu)建效果和包封率。對(duì)于平均粒徑,極差分析顯示三種因素的影響大小次序?yàn)锳>B>C。方差分析顯示三因素的p值分別為0.048、0.140和0.250,可見(jiàn)均質(zhì)壓力對(duì)粒徑有顯著影響,而其它兩因素對(duì)平均粒徑無(wú)顯著影響。因此,先將對(duì)于包封率有顯著影響的因素B及對(duì)粒徑具有顯著影響的因素A進(jìn)行水平選擇,根據(jù)極值可知組合為A1B3。因素C(乳化時(shí)間)對(duì)包封率及粒徑均無(wú)顯著影響,考慮其水平越低越節(jié)約能耗,選擇C1水平。所以,最終組合為A1B3C1,此條件下重建脂質(zhì)體的包封率為67.31%,平均粒徑為241 nm。

表5 輔酶Q10前體脂質(zhì)體制備工藝正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

2.4 凍干保護(hù)劑的選擇

實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表6所示,對(duì)于包封率,當(dāng)以海藻糖為保護(hù)劑時(shí),包封率相比于使用等量的其它兩種保護(hù)劑時(shí)更高,而使用葡萄糖為保護(hù)劑時(shí),包封率較差。并且,隨著保護(hù)劑添加量的增加,包封率也逐漸變大,這說(shuō)明凍干保護(hù)劑與卵磷脂發(fā)生作用,其保護(hù)效果決定于其與卵磷脂的比例[12]。對(duì)于水合后的平均粒徑,使用海藻糖的重建脂質(zhì)體的粒徑尺寸明顯小于使用等量其它兩種保護(hù)劑時(shí)的尺寸,隨著海藻糖的添加量由1∶1增加到1∶4,平均粒徑由212 nm逐漸減小到189 nm。當(dāng)使用其它兩種保護(hù)劑時(shí),平均粒徑在202～276 nm之間。另一方面,與凍干前的脂質(zhì)體粒徑(176 nm)相比,使用海藻糖時(shí),凍干后脂質(zhì)體粒徑的變化倍率范圍為1.07～1.20倍,而不加入凍干保護(hù)劑時(shí)的變化倍率為2.0,這說(shuō)明其對(duì)凍干前后粒徑變化的控制效果良好。

圖1為使用海藻糖作為保護(hù)劑時(shí)制備的輔酶Q10前體脂質(zhì)體的外觀。前體脂質(zhì)體粉末顏色均勻,呈顆粒或碎片狀,結(jié)構(gòu)飽滿,且沒(méi)有干縮結(jié)團(tuán)現(xiàn)象。這可能由于高濃度的糖溶液會(huì)誘導(dǎo)脂質(zhì)體膜玻璃態(tài)的形成,一旦形成玻璃態(tài),水分子的流動(dòng)減小,溶液的黏度增加,使得脂質(zhì)體膜鏈段運(yùn)動(dòng)受阻,分子的伸展和聚集受到抑制,從而保護(hù)其結(jié)構(gòu)不會(huì)發(fā)生塌陷。前體脂質(zhì)體經(jīng)過(guò)30 min水化重建后,脂質(zhì)體混懸液分散均勻,無(wú)顆粒團(tuán)聚或沉降。

表6 不同凍干保護(hù)劑對(duì)產(chǎn)品包封率及平均粒徑的影響

圖1 使用海藻糖作為凍干保護(hù)劑時(shí)制備的輔酶Q10前體脂質(zhì)體粉末及其重建液Fig.1 Proliposome of coenzyme Q10 and its reconstruction solution when trehalose was used as cryoprotectant 注：卵磷脂與海藻糖質(zhì)量比1∶2。

2.5 前體脂質(zhì)體的紅外光譜分析

圖2a～圖2c分別為空白前體脂質(zhì)體、輔酶Q10原料以及輔酶Q10前體脂質(zhì)體的紅外光譜譜圖,在輔酶Q10原料藥的紅外光譜圖中,1700～400 cm-1范圍內(nèi)出現(xiàn)了許多特征吸收峰,3000～2800 cm-1內(nèi)也有一處較為明顯的吸收。對(duì)于空白脂質(zhì)體和載藥前體脂質(zhì)體,在4000～400 cm-1范圍內(nèi),除了有兩處峰強(qiáng)度稍有所減弱外,兩者光譜圖的吸收峰位置基本一致。并且,在輔酶Q10原料譜圖中出現(xiàn)的特征吸收峰在載藥脂質(zhì)體的圖譜中并未有呈現(xiàn),這也許是由于主藥已經(jīng)被包裹在前體脂質(zhì)體的囊腔之中。

圖2 紅外光譜譜圖Fig.2 FT-IR spectrogram注:a空白脂質(zhì)體;b輔酶Q10原料;c輔酶Q10前體脂質(zhì)體。

2.6 XRD圖譜分析

圖3a～圖3c分別為空白前體脂質(zhì)體、輔酶Q10前體脂質(zhì)體以及輔酶Q10原料藥的X射線衍射譜圖,從圖可見(jiàn),輔酶Q10原料在衍射角為18.8°以及22.9°時(shí)有兩處較強(qiáng)的衍射峰,另有一些相對(duì)較弱的結(jié)晶衍射峰存在。而在空白脂質(zhì)體以及載藥前體脂質(zhì)體的譜圖中,衍射角為18.8°和22.9°處,并沒(méi)有明顯的衍射峰出現(xiàn),只在27.4°處出現(xiàn)了一個(gè)小的衍射峰,而在輔酶Q10原料的圖譜中,在這個(gè)角度時(shí)并無(wú)衍射峰出現(xiàn),這可能是由于脂質(zhì)體凍干前所加入的海藻糖引起的[13]。除了原料的主要兩個(gè)衍射峰消失以外,在原料XRD譜圖中存在的其他小峰也并未出現(xiàn)在載藥前體脂質(zhì)體的譜圖中,而且,載藥前體脂質(zhì)體在3～30。范圍內(nèi)譜圖較平穩(wěn),未出現(xiàn)明顯的衍射峰。這可能是由于輔酶Q10已經(jīng)被包藏在脂質(zhì)體的囊腔之中,或者載藥前體脂質(zhì)體中的主藥結(jié)構(gòu)已經(jīng)接近無(wú)定形狀態(tài)。

2.7 重建脂質(zhì)體溶液的沉降穩(wěn)定性

3批產(chǎn)品分別于第4,4,5 d時(shí)有極少量沉淀產(chǎn)生。觀察至第15 d時(shí),沉淀無(wú)明顯增多。可見(jiàn),重建后的脂質(zhì)體在3 d內(nèi)能夠保持穩(wěn)定。

2.8 重建脂質(zhì)體的貯存穩(wěn)定性

將按優(yōu)化配方和工藝制備的3批輔酶Q10前體脂質(zhì)體貯存于-20 ℃環(huán)境下,定期將其水化后檢測(cè)產(chǎn)品粒徑及包封率。從表7可以看出,輔酶Q10前體脂質(zhì)體具有較好的冷藏穩(wěn)定性,貯藏90 d后平均粒徑與包封率均無(wú)明顯改變。前體脂質(zhì)體粉末顏色未變,色澤均勻,無(wú)坍塌或干縮現(xiàn)象,且水化重建液無(wú)沉淀物產(chǎn)生。

表7 載藥前體脂質(zhì)體的貯存穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)(x±s,n=3)

圖3 X射線衍射譜圖Fig.3 XRD spectrogram注:a：空白脂質(zhì)體;b：輔酶Q10前體脂質(zhì)體;c：輔酶Q10原料。

3 結(jié)論

在本研究中,采用高壓均質(zhì)結(jié)合冷凍干燥法制備輔酶Q10前體脂質(zhì)體,最終選擇磷脂與膽固醇的質(zhì)量比4∶1,磷脂與輔酶Q10的質(zhì)量比10∶1,高壓均質(zhì)壓力40 MPa,減壓蒸發(fā)溫度45 ℃,乳化時(shí)間5 min,卵磷脂與海藻糖質(zhì)量比1∶2。制得的前體脂質(zhì)體水化重建后平均粒徑為241 nm,包封率67.31%。紅外光譜及X射線衍射分析表明,輔酶Q10已被包裹于脂質(zhì)體囊腔之中,或部分主藥呈無(wú)定形態(tài)。在本研究中并未使用表面活性劑,有研究表明加入適宜的表面活性劑能加快脂質(zhì)體的封裝速率,可有效控制脂質(zhì)體的形狀和粒徑,從而穩(wěn)定或提高包封率[14]。所以,對(duì)于所制備的輔酶Q10前體脂質(zhì)體來(lái)說(shuō),如果想要進(jìn)一步改進(jìn)產(chǎn)品的各種性能和功能,可以嘗試加入不同的表面活性劑來(lái)實(shí)現(xiàn)。

[1]Garrido-Maraver J,Cordero M D,Oropesa-ávila M,et al.

Coenzyme Q10 Therapy[J]. Molecular Syndromology,2014,5(3-4):187.

[2]Borek C. Dietary Antioxidants and Human Cancer[J]. Integrative Cancer Therapies,2004,3(4):333-341.

[3]Nachtigal M,Patterson R E,Stratton K L, et al. Dietary Supplements and Weight Control in A Middle-age Population[J].Journal of Alternative & Complementary Medicine,2005,11(5):909-915.

[4]Barakat A,Shegokar R,Dittgen M,et al. Coenzyme Q10 Oral Bioavailability:Effect of Formulation Type[J]. Journal of Pharmaceutical Investigation,2013,43(6):431-451.

[5]耿亞男,曹棟,聶新艷,等. 氧化對(duì)脂質(zhì)體膜性質(zhì)的影響[J]. 食品工業(yè)科技,2013,34(7):64-67.

[6]Hafeez A,Jain D U,Singh J,et al. Recent Advances in Transdermal Drug Delivery System(tdds):An Overview[J]. Journal of Scientific and Innovative Research,2013,2(3):695-709.

[7]Maherani B,Arab-Tehrany E,R Mozafari M,et al. Liposomes:A Review of Manufacturing Techniques and Targeting Strategies[J]. Current Nanoscience,2011,7(3):436-452.

[8]Coderch L,Fonollosa J,De Pera M,et al. Influence of Cholesterol on Liposome Fluidity by Epr:Relationship with Percutaneous Absorption[J]. Journal of Controlled Release,2000,68(1):85-95.

[9]Sulkowski W,Pentak D,Nowak K,et al. The Influence of Temperature,Cholesterol Content and ph on Liposome Stability[J]. Journal of Molecular Structure,2005,744:737-747.

[10]Harrigan P,Madden T,Cullis P. Protection of Liposomes during Dehydration or Freezing[J]. Chemistry and Physics of Lipids,1990,52(2):139-149.

[11]Crowe L M,Crowe J H,Rudolph A,et al. Preservation of freeze-dried liposomes by trehalose[J]. Archives of biochemistry and biophysics,1985,242(1):240-247.

[12]Swaminathan J,Ehrhardt C. Effect of Lyophilization on Liposomal Encapsulation of Salmon Calcitonin[J]. Journal of Liposome Research,2014,24(4):297-303.

[13]Miao S,Roos Y H. Crystallization Kinetics and X-ray Diffraction of Crystals Formed in Amorphous Lactose,Trehalose,and Lactose/Trehalose Mixtures[J]. Journal of Food Science,2005,70(5):E350-E358.

[14]Agarwal R,Katare O,Vyas S. Preparation andinvitroEvaluation of Liposomal/Niosomal Delivery Systems for Antipsoriatic Drug Dithranol[J]. International Journal of Pharmaceutics,2001,228(1):43-52.

Study on the preparation of coenzyme Q10precursor liposomes and its quality

SUI Xiao-yu,DONG Xiao-ze,HAN Cui-yan,YUAN Cheng,LIU Chang,MA Xiao-xing,LIU Ting-ting*

(College of Pharmacy,Qiqihar Medical University,Qiqihar 161006,China)

To prepare coenzyme Q10precursor liposomes using high pressure homogenization combine with freeze drying. Orthogonal experimental was performed for optimizing preparation process and formulations of precursor liposomes. The quality was investigated by infrared spectroscopy,x ray diffraction,etc. Meanwhile,the stability of product was investigated. In this study,average particle size of reconstruction solution of precursor liposome was 241 nm,and encapsulation efficiency was 67.31%. There were no significant changes of the quality after 90 days of storage. The precursor liposome prepared in this study had good quality and stability. Moreover,it is easy to manufacture and convenient for application in food.

coenzyme Q10;precursor liposomes;freeze drying;orthogonal design

2015-02-09

隋小宇(1980-)，男，博士，講師，研究方向：藥物傳遞系統(tǒng)，E-mail:suixiaoyu@outlook.com。

*通訊作者:劉婷婷(1984-)，女，博士，講師，研究方向：藥物色譜、光譜分析，E-mail:ltting@outlook.com。

黑龍江省教育廳科學(xué)技術(shù)研究項(xiàng)目(12541918)。

TS218

A

1002-0306(2015)21-0127-06

10.13386/j.issn1002-0306.2015.21.018