固定化苯丙氨酸脫氨酶拆分D,L-苯丙氨酸制備D-苯丙氨酸

房月芹,朱龍寶,黃 楠,周 麗,丁重陽,劉 穎,周哲敏,*

(1.江南大學環境與土木工程學院,江蘇無錫 214122;(2.江南大學生物工程學院工業生物技術教育部重點實驗室,江蘇無錫 214122) (3.安徽工程大學生物化學工程學院,安徽蕪湖 241000)

固定化苯丙氨酸脫氨酶拆分D,L-苯丙氨酸制備D-苯丙氨酸

房月芹1,朱龍寶2,3,黃 楠2,周 麗2,丁重陽2,劉 穎1,周哲敏2,*

(1.江南大學環境與土木工程學院,江蘇無錫 214122;(2.江南大學生物工程學院工業生物技術教育部重點實驗室,江蘇無錫 214122) (3.安徽工程大學生物化學工程學院,安徽蕪湖 241000)

為了建立新的D-苯丙氨酸生產工藝,對固定化苯丙氨酸解氨酶(PAL)拆分D,L-苯丙氨酸進行了研究。以介孔材料(MCM-41)為載體固定PAL,將其用于拆分消旋體D,L-苯丙氨酸制備高光學純的D-苯丙氨酸。最佳的固定化條件是載酶量為50mg/g、殼聚糖濃度為0.1%(w/v)、戊二醛濃度為0.05%(v/v),固定化酶的活性達到最大,酶活保留達到92%,重復利用20次后,活性仍能保持85%。將制備的固定化酶應用于D,L-苯丙氨酸的拆分,反應24hL-苯丙氨酸轉化率達到98%,D-苯丙氨酸的ee值達到96%,且連續拆分10個批次后固定化酶對L-苯丙氨酸的轉化率仍保持在95%以上。因此,高效穩定的固定化PAL在拆分D,L-苯丙氨酸生產D-苯丙氨酸中具有良好的應用前景。

苯丙氨酸脫氨酶,介孔材料MCM-41,固定化,D,L-苯丙氨酸拆分

D-苯丙氨酸能增強人體免疫功能,具有出色的鎮痛作用,常用做抗腫瘤藥物、糖尿病治療藥物及HIV蛋白酶抑制劑的生產原料。目前通常采用不對稱化學合成法[1-2]、氨基酰化酶法[3]、海因酶法[4]等方法制備。這些方法都有一定的局限性,其中不對稱化學合成法采用的手性助劑來源有限,價格昂貴;氨基酰化酶法需要對底物進行乙酰化,工藝路線長;海因酶法反應步驟多,產物分離復雜。

PAL特異性催化L-苯丙氨酸分解為反式肉桂酸和氨[5],應用于合成芳香丙氨酸和治療苯丙酮尿癥[6]。在工業應用方面鮮有報道,僅黃建坡等采用固定化粘紅酵母細胞法生產D-苯丙氨酸[7]。但由于在粘紅酵母細胞內PAL的表達量較低,且固定化細胞在催化反應時底物和產物進出細胞會受到傳質阻力,所以轉化速率較低。本實驗室前期已克隆了來源于粘紅酵母的PAL基因,并在大腸桿菌中實現了高效表達,該酶熱穩定性高,pH耐受性好,非常適用于工業應用[8]。

介孔二氧化硅如MCI-41由于具有大比表面積和孔徑率,高機械強度、表面具有活性基團等優點而被廣泛用作固定化材料[9-10]。MCM-41孔徑在1～30nm,與自然界大部分酶的直徑相近,酶能進入介孔材料孔道內[11-12]。由于酵母PAL的直徑在10nm內[13],因而選擇孔徑為2～12nm的MCM-41作為載體,酶不僅能進入孔道內,而且孔徑越小,比表面就越大,酶的裝載量就越大。本文以介孔材料MCM-41為載體,采用了一種簡單有效的吸附后交聯方法[14]對PAL進行固定化。并用固定化酶對D,L-苯丙氨酸進行拆分制備D-苯丙氨酸,初步探索了D-苯丙氨酸生產的可行性。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

PAL為本實驗室自制[8];介孔分子篩MCM-41、殼聚糖、戊二醛、D,L-苯丙氨酸、Bradford蛋白濃度測定液均為市售分析純試劑。

大容量冷凍離心機 日本日立;超聲波細胞破碎儀 日本索尼公司;HPLC 日本日立;培養箱和搖床 博迅實業有限公司

1.2 實驗方法

1.2.1 PAL的固定化 在5mL蛋白濃度為0.5mg/mL的PAL溶液中(用0.05mol/L、pH8.5 Tris-HCl緩沖液配制),加入50mg介孔材料MCM-41,置于15℃的恒溫震蕩器(200r/min)吸附4h,所得固定化酶用緩沖液洗凈后加入終濃度為0.1%(w/v)的殼聚糖溶液,持續攪拌2h并用緩沖液洗凈后重懸于緩沖液中,最后以體積分數為0.05%(v/v)的戊二醛溶液于4℃下交聯固定化酶1h[9-10]。

1.2.2 吸附量和酶活的測定 用Bradford法分別測定吸附前酶液中和吸附后上清中的蛋白濃度,蛋白量之差為固定化酶的吸附量。在反應體系中加入與游離酶等蛋白量的固定化酶按照文獻[7]進行酶活測定。

酶活保留(%)=固定化酶酶活/游離酶酶活×100

相對酶活(%)=固定化酶酶活/固定化酶的最高酶活×100

1.2.3 固定化PAL的性質 在反應條件為45℃,pH8.5下對固定化酶的酶活進行20次重復測定,研究其操作穩定性。

1.2.4 固定化PAL拆分D,L-苯丙氨酸 將含有30mg PAL的固定化酶加入1L D,L-苯丙氨酸溶液中(D-苯丙氨酸和L-苯丙氨酸各50mmol/L,pH8.5),在45℃下攪拌反應,每隔3h取出0.1mL反應液,測定其中L-苯丙氨酸的含量,反應24h后結束轉化過程。

1.2.5 轉化率的測定 拆分反應中取出的反應液按照文獻[15]測定其中D-苯丙氨酸和L-苯丙氨酸的含量,計算出L-苯丙氨酸的轉化率。

轉化率=(C0-Ci)/C0×100%

式中：Ci:第i次所取反應液中L-苯丙氨酸的濃度;C0:轉化前D,L-苯丙氨酸溶液中L-苯丙氨酸的濃度。

式中：D表示D-phe的濃度;L表示L-phe的濃度。

2 結果與分析

2.1 MCM-41的載酶量

從圖1可以看出,當載酶量為50mg/g時,固定化酶的相對酶活最高。載酶量對相對酶活的影響與介孔分子篩MCM-41的通道大小有關,當介孔材料MCM-41的孔道被酶分子所飽和時,固定化酶活性達到最大;當載酶量較小時,酶分子為了能夠獲得對載體孔道和表面的最大接觸,會發生變形和伸展而導致構象變化,引起酶活損失[15];而當載酶量超過最適載量后,又會使通道內阻塞,底物難以進入通道,只能與載體表面所固定的酶分子反應,相對活力不增反降。

圖1 載酶量對固定化酶相對酶活的影響Fig.1 Effect of loading amount on relative activity of immobilized enzyme

2.2 殼聚糖濃度對固定化酶的影響

由圖2可知,當殼聚糖濃度為0.1%(w/v)時,固定化酶的相對酶活最高;隨著殼聚糖濃度進一步升高,相對酶活開始下降。因為在殼聚糖濃度為0.1%(w/v)時,既能夠保證酶分子不發生滲漏又不至于形成過于致密的網狀層阻礙底物與產物的進出,固定化酶的酶活才能達到最高。

圖2 殼聚糖濃度對固定化酶的影響Fig.2 Effect of chitosan concentration on relative activity of immobilized enzyme

2.3 戊二醛濃度對固定化酶的影響

由圖3可知,在戊二醛濃度較低時,相對酶活隨著戊二醛濃度的升高而升高,在戊二醛濃度為0.05%(v/v)時,相對酶活最高;此后,固定化酶的相對酶活隨著戊二醛濃度升高而迅速降低。這是由于戊二醛的主要作用是交聯殼聚糖層,在濃度較低時,不能形成穩定的殼聚糖網狀結構,固定化酶不穩定有酶滲漏的情況發生[10],導致相對酶活較低;但是,過量的戊二醛又會過度交聯酶分子,使酶活降低。因此,固定化PAL的最佳條件確定為:載酶量為50mg/g,殼聚糖溶液濃度為1%(w/v),戊二醛溶液濃度為0.05%(v/v)。

圖3 戊二醛濃度對固定化酶的影響Fig.3 Effect of glutaraldehyde concentration on relative activity of immobilized enzyme

2.4 固定化PAL的性質

在工業生產中,固定化酶的操作穩定性高就能增加其在催化反應中的重復使用次數,是節約成本的重要條件[16]。圖4顯示的是固定化PAL的操作穩定性。在20次催化反應后固定化酶的酶活僅比初始酶活下降了15%,比Cui[17]等制備的固定化PAL有明顯的提高。以MCM-41為載體,通過先吸附后交聯制備的固定化PAL之所以能有較高的穩定性,可能是由MCM-41獨特的有序介孔結構及殼聚糖與戊二醛交聯所形成的堅固網狀層決定的,有序介孔結構能保證酶分子的均勻分布而外層的網狀層則有效地阻止酶分子的滲漏[9-10]。這些結果表明,本實驗制備的固定化酶在性質上符合工業應用所需。

圖4 固定化酶的操作穩定性Fig. 4 The operational stability of the immobilized enzyme

2.5 拆分反應的效率

將上述制備的固定化酶應用于拆分D,L-苯丙氨酸(D-苯丙氨酸和L-苯丙氨酸各0.05mol/L,pH8.5),結果如圖5所示。可見,在反應的前12h L-苯丙氨酸的轉化率迅速上升到78%;而此后拆分反應的轉化速率越來越慢,反應24h后,轉化率達到98%以上。轉化率隨時間變化的規律,可以由拆分反應中的產物抑制作用來解釋。在反應前期,生成的反式肉桂酸的量很少,L-苯丙氨酸濃度高,反應速率大,L-苯丙氨酸的轉化率迅速上升;隨著底物中L-苯丙氨酸被大量地轉化為反式肉桂酸,高濃度的反式肉桂酸嚴重抑制拆分反應的進行,從而導致轉化12h后轉化率增加的速率顯著下降;直至反應24h,底物中L-苯丙氨酸幾乎被轉化完全,轉化率到達98%以上,可視為拆分反應已經完成。所以,實驗中將24h定為拆分反應的終點。

圖5 固定化酶拆分反應的效率Fig. 5 The chiral resolution efficiency of the immobilized enzyme

2.6 底物濃度對拆分效率的影響

底物濃度不僅是判斷反應效率的重要參數,同時還會影響拆分效率。表1顯示的是不同D,L-苯丙氨酸濃度下的固定化酶拆分效率。由表可知,在濃度較低時,固定化酶將D,L-Phe中的L-Phe完全轉化所需時間和轉化效率不同,隨著濃度的增加,拆分效率越來越高,在接近D,L-Phe飽和濃度[18]時,效率達到最高為每小時轉化2.08mmol L-Phe。

表1 不同底物濃度下的拆分效率Table 1 Effect of different concentration of D,L-Phe on the chiral resolution efficiency

從工業制備的規模和效率上綜合考慮,高底物濃度下的拆分反應有利于節約成本,所以本實驗選擇100mmol/L的D,L-Phe進行反應。

2.7 拆分反應的批次穩定性

批次穩定性是衡量工藝是否可行的重要條件。圖6顯示的是固定化PAL拆分D,L-苯丙氨酸的批次穩定性。由圖可知,固定化酶在連續進行10個批次拆分反應的過程中始終能夠將L-苯丙氨酸的轉化率保持在95%以上的水平。

圖6 固定化酶拆分的批次穩定性Fig. 6 The batch stability of the immobilized enzyme

3 結論

利用介孔分子篩MCM-41、殼聚糖、戊二醛采取先吸附后交聯的方法固定化PAL,經過條件優化得到了酶活保留高達92%、穩定性良好的固定化酶。將固定化PAL用于催化拆分D,L-苯丙氨酸的反應中,固定化酶的操作穩定性高,在連續10個批次的拆分反應后,轉化率始終保持在95%以上。因此,固定化PAL拆分D,L-苯丙氨酸為D-苯丙氨酸高效制備提供了新方法。

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Chiral resolution ofD,L-phenylalanineusing immobilized phenylalanine ammonia-lyase for production ofD-phenylalanine

FANG Yue-qin1,ZHU Long-bao2,3,HUANG Nan2,ZHOU Li2,DING Zhong-yang2,LIU Ying1,ZHOU Zhe-min2，*

(1.School of Environment and Civil Engineering,Jiangnan University,Wuxi 214122,China；2.School of Biotechnology,Jiangnan University,Key Laboratory of Industrial Biotechnology,Ministry of Education,Wuxi 214122,China；3.School of Biochemical Engineering,Anhui Polytechnic University,Wuhu 241000,China)

In order to establish a new method for the production of D-phenylalanine,the chiral resolution of D,L-phenylalanine using immobilized phenylalanine ammonia lyase(PAL)was investigated. The mesoporous silica materials MCM-41 was used as support. Under the optical immobilization conditions,a maximum activity of PAL was 92% of the free enzyme. The reusability of immobilized enzyme retained 85% activity after 20 cycles. Using the immobilized PAL to catalyze resolution of D,L-phenylalanine,a 98% conversion ratio of L-phenylalanine was attained within 24h,and the enantiomeric excess value of D-phenylalanine attained 96%. The immobilization enzyme ran continuously for 10 batches,the conversion ratio retained above 95%. Therefore,the immobilized PAL showed commercial application for the production of D-phenylalanine from chiral resolution of D,L-phenylalanine.

phenylalanine ammonia lyase(PAL);MCM-41;immobilization;chiral resolution of D,L-phenylalanine

2014-07-23

房月芹(1969-)，女，碩士，實驗師，研究方向：分子生物學。

*通訊作者:周哲敏(1969-)，男，博士，教授，研究方向：酶工程與技術。

工業生物技術教育部重點實驗開發課題(KLIB-KF201107,KLIB-KF201203)。

TS255.1

B

1002-0306(2015)11-0243-04

10.13386/j.issn1002-0306.2015.11.041