羊肚菌液體深層發酵工藝優化的研究

滕國生，賈東旭,郭含笑,劉 勇,范春艷,武麗達,佟 毅,*

(1.吉林中糧生化有限公司(玉米深加工國家工程研究中心),吉林長春 130012;2.長春工業大學,吉林長春 130012;3.吉林大學生命科學學院,吉林長春 130012)

羊肚菌液體深層發酵工藝優化的研究

滕國生1,2，賈東旭3,郭含笑3,劉 勇1,范春艷1,武麗達1,佟 毅1,*

(1.吉林中糧生化有限公司(玉米深加工國家工程研究中心),吉林長春 130012;2.長春工業大學,吉林長春 130012;3.吉林大學生命科學學院,吉林長春 130012)

利用期望函數將菌絲體干重、胞內多糖、蛋白質及甘露醇含量綜合為期望值Da,并以此作為實驗的評價指標。應用Plackett-Burman設計對影響羊肚菌發酵罐液體培養條件的因素進行篩選,所選取的8個因素為發酵培養基初始pH、轉速、發酵溫度、接種量、通氣量、發酵時間、種齡以及裝液量。在得到裝液量、接種量和初始pH為顯著影響因素后,利用Box-Behnken設計深入優化。通過SAS Version 8.02軟件對實驗結果進行響應面回歸分析,利用Matlab2012a軟件對實驗結果進行神經網絡結合遺傳算法分析,通過比較各模型Da預測值,即神經網絡結合遺傳算法分析結果,從而獲得羊肚菌5L發酵罐液體培養最佳條件:初始pH6.83,轉速200r/min,發酵時間 4.5d,發酵溫度26℃,接種量3%,種齡3d,通氣量200L/h,裝液量 3.22L/5L。模型預測期望值0.5220,驗證值0.4987,模型具有良好的擬合度及預測能力。

羊肚菌,液體發酵,Plackett-Burman設計,神經網絡結合遺傳算法,期望函數

羊肚菌[Morehellaesculenta],別稱羊肚菜、羊肚蘑、羊肚子,在我國分布廣泛,是世界公認的食用菌,其不僅口感好,肉質鮮嫩,而且富含營養價值,具有良好的藥用價值[1-2]。羊肚菌富含多糖、蛋白類、氨基酸、甘露醇和脂肪酸等類成分,目前已探究其營養成分具有增強免疫、減緩疲勞、抗腫瘤和抗氧化方面均具有顯著功效[3-4]。近年來,鑒于羊肚菌野生資源逐漸匱乏同時其子實體生長環境要求嚴格,其人工栽培技術尚未成熟,因此羊肚菌的液體發酵生產途徑是解決其工業化、集約化的重要途徑,近年來對羊肚菌液體深層發酵中培養基配方組分方面優化的研究常見報道,諸如聶建軍等優化黑脈羊肚菌菌絲體培養基配方的研究[5],吳新宇等對新疆野生羊肚菌液體培養基組分的研究[6]等,而針對羊肚菌液體深層發酵工藝中培養基配方外的培養條件優化方面研究不多。

Plackett-Burman設計是一種兩水平的實驗設計方法,可以利用最少的實驗次數,從眾多的考察因素中快速篩選主要的影響因素,廣泛地用于因子主效應的估計中[7]。響應面法包含設計實驗方案、建立回歸模型、評估因子效應、獲得因子的最佳水平等功能,優于正交實驗和因子實驗等方法,具有實驗次數少、周期短和精度高等優點[8]。遺傳算法源于生物遺傳學和適者生存的自然規律,是由美國Michigan大學Holland教授發展建立的[9]。其能夠解決有約束的最優化問題,只需要給出目標函數、變量取值范圍和需滿足的其他等式和不等式的約束條件,就可以通過迭代,逐步搜索到最優解[10]。基于化學計量學的實驗設計廣泛應用于化學、化工以及生物方面[11-13]。

本研究先利用Plackett-Burman設計對影響羊肚菌發酵罐培養條件的諸多因素進行考察,對篩選得到的關鍵因素采用Box-Behnken設計深入優化,利用Design-Expert.V8.0.6.1軟件對實驗結果進行響應面回歸分析,利用Matlab2012a軟件對實驗結果進行神經網絡結合遺傳算法分析,通過比較,獲得羊肚菌5L發酵罐液體培養最佳條件。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

羊肚菌菌株,為中科院微生物所菌種保存中心購得CGMCC5.620。

甘露醇 標準品美國Sigma公司;甲醇 北京化工色譜;高碘酸鈉、鹽酸、MgSO4·7H2O、KH2PO4·3H2O、葡萄糖均為分析純 購于北京化工廠;維生素B1、蔗糖、蛋白胨、酵母浸粉均為生化試劑 購于北京奧博星生物技術公司。

全自動在位滅菌發酵系統,5L全自動發酵罐,真空凍干機,德國Eppendorf 5810R型高速冷凍離心機,日本島津LC-10AT高效液相色譜儀。

1.2 培養方法

種子與發酵培養基:葡萄糖10g/L,蔗糖10g/L,蛋白胨10g/L,酵母浸粉10g/L,KH2PO4·3H2O 3g/L,MgSO4·7H2O 3g/L,VB10.1g/L。

種子培養:500mL搖瓶裝入種子培養基200mL,接入5%的菌種培養液,26℃振蕩(150r/min)培養,培養時間(種齡)按照優化條件所需進行。

1.3 分析方法

1.3.1 干重指標的測定 發酵時間截止后,收集200mL發酵液,5000r/min離心10min,棄去上清,添加適量蒸餾水水洗菌絲體并離心,收集最終沉淀,冷凍干燥,稱量即可。

1.3.2 蛋白質含量的測定 采用凱氏定氮法測定菌絲體中蛋白質的含量[14]。

1.3.3 胞內多糖含量的測定 采用蒽酮硫酸法測定胞內多糖含量[15]。

1.3.4 甘露醇含量的測定 利用比色法測定菌絲體中甘露醇的含量[16]。

1.4 期望函數的建立

采用期望函數將菌絲體干重、胞內多糖、蛋白質和甘露醇的產量綜合為一個考察指標期望值(Da),每一個考察指標(響應值)均按公式(1)轉換成無量綱的期望值后,通過公式(2)綜合為Da。期望函數的平衡尺度d范圍為0～1,d=0時說明響應值嚴重偏離目標值,d=1說明響應值與目標值接近。d隨著所期望的響應值增加而增加。由公示得出考察指標越重要,其權重值越高。yi值越高,Da值越大。羊肚菌發酵的考察指標和期望最低響應值,期望最高響應值及權重值如表1,其中yil為該考查指標的最低期望值,與公式(1)中Li等同,而yih為該考察指標的最高期望值,與公式(1)中Ei等同。

式(1)

w1+w2+w3+Λwi=1

式(2)

wi為第i個指標的權重值;n是考察變量的總數。

表1 期望函數參數表Table 1 The parameters of the desirability function

1.5 羊肚菌5L發酵罐培養條件優化

1.5.1 Plackett-Burman設計實驗 采用Plackett-Burman實驗對影響羊肚菌5L發酵罐液體培養條件的因素:發酵培養基初始pH、轉速、發酵溫度、接種量、通氣量、發酵時間、種齡以及裝液量進行考察,以Da作為評價指標,確定顯著影響因素。本實驗選取的影響因素共8個,選用N=12的Plackett-Burman設計表(見表2)。

表2 Plackett-Burman實驗方案及結果Table 2 The design matrix and results of Plackett-Burman design

1.5.2 Box-Behnken設計實驗 以Plackett-Burman設計實驗結果為基礎,采用3因素3水平的Box-Behnken中心組合實驗設計,實驗設計方案及結果見表4。利用SAS Version 8.02(SAS Institute Inc.,USA)軟件對實驗結果進行響應面回歸分析,利用Matlab2012a軟件對實驗結果進行神經網絡結合遺傳算法分析,通過比較獲得羊肚菌5L發酵罐液體發酵最近培養條件。

表4 Box-Behnken設計實驗方案及結果Table 4 The design matrix and the results of Box-Behnken design experiment

1.5.3 驗證實驗 按照SAS Version 8.02(SAS Institute Inc.,USA)和Matlab2012a軟件優化獲得的5L發酵罐培養條件分別進行3組平行實驗,以確定模型和優化方法的可靠性和準確性。

2 結果與分析

2.1 Plackett-Burman實驗結果分析

采用SAS Version 8.02(SAS Institute Inc.,USA)軟件分析實驗結果,得到多元一次方程(3)。

Y(Da)=0.3382+0.0074Z1+0.0222Z2-0.0425Z3-0.0049Z4+0.0107Z5-0.0006Z6-0.0069Z7+0.0477Z8

式(3)

決定系數(R2)用來評價模型的擬合度,R2值越接近1,模型預測能力越好。實驗中R2=0.9949,說明99.49%的期望值變化可以用所建立的模型解釋。F檢驗中p值被用來評價各因素的顯著水平,當p<0.05被認為是具有統計學意義上顯著性。回歸分析結果如表3,p=0.0024,說明模型顯著可靠,能很好地描述實驗因素與響應值間的關系。各考察因素的重要性依次為Z8>Z3>Z2>Z5>Z1>Z7>Z4>Z6。其中顯著影響因素分別為裝液量(Z8),接種量(Z3),初始pH(Z2)和轉速(Z5),其他因素的置信水平低于95%,為不顯著項。根據方程(3)可知,發酵時間、轉速和接種量的系數為正,表明對期望值具有正效應;相反,初始pH對期望值具有負效應,該結果說明增加發酵時間,轉速和接種量的水平或者降低初始pH有利于提高期望值,增加羊肚菌的各有效成分產量。鑒于裝液量(Z8),接種量(Z3)和初始pH(Z2),3個因素對結果影響處于極其顯著下,因此基于該3個因素進行下一步優化。

表3 Plackett-Burman設計實驗回歸分析結果Table 3 The results of regression analysis of Plackett-Burman design experiment

注:顯著性分析,p<0.001為***,p<0.01為**,p<0.05為*。

表5 回歸模型方差分析Table 5 The regression model analysis of variance

2.2 響應面分析

采用SAS Version 8.02(SAS Institute Inc.,USA)對Box-Behnken設計實驗所得數據進行響應面回歸分析,獲得經多元二次回歸方程(4)。

Y(Da)=0.5019+0.0195V1-0.0051V2+0.0206V3-0.0047V1V2-0.0020V1V3-0.0007V2V3-0.0102V12-0.0202V22-0.0254V32

式(4)

模型中決定系數R2為0.9092,說明90.92%的期望值變化可通過該多項式解釋。模型p<0.05證明了二次回歸模型具有顯著性。模型失擬項的F和p值分別為10.4308和0.0887,不顯著。采用t檢驗對模型的各項系數進行顯著性分析,結果如表5顯示,一次項(V1和V3),二次項(V12、V22和V32)對響應值的影響具有顯著性(p<0.05)。根據模型預測知,在發酵罐液體培養條件為:初始pH6.37,轉速200r/min,發酵時間4.5d,發酵溫度26℃,接種量4.51%,種齡3d,通氣量200L/h,裝液量3.99L/5L情況下,Da預測值為0.5159。

2.3 神經網絡結合遺傳算法分析結果

應用Matlab 2012a對實驗數據進行計算,15組實驗隨機分為校正集(11組)、測試集(2組)和預測集(2組),用于建立并檢測神經網絡模型的適應性和預測能力。以逼近度(Dv)值做為評價指標優選神經網絡中最佳隱含層節點數(公式5)。采用遺傳算法來搜索基于實驗數據內最大Dv值時的最佳條件,適應度函數的定義如公式(6)。此外,基于遺傳算法的優化模擬將被重復使用,每次隨機初始化優選方案的種群。不同的初始種群將用來確保每次遺傳算法開始搜索都是始于不同搜索子集的優化方案,幫助定位最佳方案的搜索[7]。

式(5)

Fitness=-(響應值)

式(6)

根據Dv值,選擇11為最佳隱含層節點數(圖1A),最優神經網絡模型的決定系數(R2)為0.9596,說明神經網絡模型的擬合度好。訓練集(RMSEc)、測試集(RMSEt)和預測集(RMSEp)的均方根誤差分別為0.0101,0.0099和0.0117。當神經網絡模型建立后,采用遺傳算法優化發酵培養條件并獲得預測期望值(圖2)。優化后羊肚菌5L發酵罐液體培養條件為:初始pH6.83,轉速 200r/min,發酵時間 4.5d,發酵溫度26℃,接種量3%,種齡3d,通氣量200L/h,裝液量 3.22L/5L,此條件下預測期望值為0.5220。

圖1 隱藏結點數對逼近度的影響Fig.1 Effect of the number of hidden nodes on Da

圖2 遺傳代數對擬合度的影響Fig.2 The effect of the number of generation on fitness

2.4 驗證實驗

按照SAS Version 8.02和Matlab2012a優化的羊肚菌5L發酵罐培養條件分別進行3組平行實驗。采用SAS Version 8.02軟件進行響應面分析得到的預測期望值為0.5159,平均驗證結果為0.4779,誤差7.36%。利用Matlab2012a軟件進行神經網絡結合遺傳算法分析得到的預測期望值為0.5220,平均驗證結果為0.4987,誤差為4.46%。通過比較,神經網絡結合遺傳算法分析結果作為最佳的羊肚菌5L發酵罐液體培養條件:初始pH6.83,轉速200r/min,發酵時間 4.5d,發酵溫度26℃,接種量3%,種齡3d,通氣量200L/h,裝液量 3.22L/5L。

3 結論

本文利用期望函數將菌絲體干重、胞內多糖、蛋白質及甘露醇含量綜合為期望值Da,并以此作為實驗的評價指標。通過Plackett-Burman實驗對影響羊肚菌發酵罐液體培養的8個因素進行篩選,在獲得裝液量、接種量和初始pH為顯著影響因素后,對其利用Box-Behnken設計深入優化。分別利用SAS Version 8.02軟件對實驗結果進行響應面回歸分析,利用Matlab2012a軟件對實驗結果進行神經網絡結合遺傳算法分析,通過比較各模型分析方法得到的預測期望值,綜合預測期望值和平均測定值,即神經網絡結合遺傳算法分析結果為最佳,從而獲得羊肚菌5 L發酵罐液體培養最佳條件:初始pH6.83,轉速 200 r/min,發酵時間 4.5d,發酵溫度26℃,接種量3%,種齡3d,通氣量200L/h,裝液量 3.22L/5L。本研究通過采用的多種統計學方法科學有效的對羊肚菌5L發酵罐液體培養條件進行逐步優化,為實際生產提供很好的指導作用。

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Optimization ofMorehellaesculentasubmerge fermentation conditions

TENG Guo-sheng1,2,JIA Dong-xu3,GUO Han-xiao3,LIU Yong1,FAN Chun-yan1,WU Li-da1,TONG Yi1，*

(1.Jilin COFCO Biochemistry CO. ,LTD(National Engineering Research center of Corn Processing),Changchun 130012,China;2.Changchun University of Technology,Changchun 130012,China;3.School of Life Sciences,Jilin University,Changchun 130012,China)

Using desirability function,four indexes including mycelium dry weight,intracellular polysaccharide,protein and mannitol yield were uniformed into one expected value(Da)which was further served as the assessment criteria. In our present study,Plackett-Burman design was applied to evaluate the effects of eight variables including initial pH,rotate speed,fermentation temperature,inoculum size,ventilation volume,culture time,inoculum age and loading volume on Da value duringMorehellaesculentasubmerge fermentation via fermenter. Culture time,initial pH and rotate speed were found to influence Da value significantly and were further optimized by Box-Behnken design. The data obtained from Box-Behnken design was analyzed by both with response surface regression(SAS Version 8.02 software)and neural network combining genetic algorithm method(Matlab2012a software). After compared Da predicted value of each model,the Da predicted value of neural network combining genetic algorithm method was the highest,so that the optimumMorehellaesculentasubmerge fermentation conditions via fermenter was obtained as follows:initial pH6.83,rotate speed 200r/min,culture time 4.5d,fermentation temperature 26℃,inoculum size 3%,ventilation volume 200L/h,inoculum age 3d,and loading volume 3.22L/5L. The predicted Da value of the optimum model was 0.5220 and the experimental Da value was 0.4987. The model possesses well fitness and predictive ability.

Morehellaesculenta;submerge fermentation;Plackett-Burman design;neural network combining genetic algorithm;Desirability function

2014-07-28

滕國生(1978-)，男，博士，講師，主要從事生物發酵研究。

*通訊作者:佟毅(1963-)，男，博士，高級工程師，主要從事生物工程發酵的研究。

國家科技部重點支撐項目(2012BAL29B05)。

TS201.3

A

1002-0306(2015)11-0162-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.11.024