氧化脅迫聯合UV、DES誘變選育高產、高分子量透明質酸菌株

湯 棟,榮紹豐,管世敏,李茜茜,王敬文

(上海應用技術學院香料香精技術與工程學院,上海 201418)

氧化脅迫聯合UV、DES誘變選育高產、高分子量透明質酸菌株

湯 棟,榮紹豐*,管世敏,李茜茜,王敬文

(上海應用技術學院香料香精技術與工程學院,上海 201418)

本實驗以馬疫鏈球菌MF003為出發菌,通過H2O2氧化脅迫培養、紫外輻照(UV)和硫酸二乙酯(DES)對菌株進行復合誘變,獲得一株高產、高分子量透明質酸酶缺陷菌株ZD-25。經搖瓶發酵培養,該菌株透明質酸產量達到1.61g/L,相對分子量達到2.13×106u,分別比原始菌株提高了120.5%,57.8%。經過多次傳代后,菌株透明質酸產量及相對分子量具有較高的穩定性。經5L發酵罐初步發酵,突變株ZD-25的透明質酸產量達到4.26g/L,相對分子量達到2.90×106u,分別比原始菌株提高了166.3%,93.3%。

氧化脅迫,復合誘變,透明質酸,馬疫鏈球菌

透明質酸(hyaluronic acid,以下簡稱HA)[1]是一種均勻重復的線性粘多糖,由2000～25000個葡萄糖醛酸和N-乙酰胺葡萄糖通過β-1,3和β-1,4糖苷鍵交替串聯得到。目前已經廣泛的用于多個領域,例如醫藥工業方面、食品工業方面[2]。

目前HA的獲取主要通過動物組織提取法及發酵法。發酵法制備HA原料較動物組織提取法具有易得、產量較高、提取方便和品質較好的優點,因此發酵法制備HA逐漸取代提取法成為趨勢。用于發酵HA的菌種多為C組鏈球菌,主要是馬疫鏈球菌和獸疫鏈球菌。但是不同的菌株在發酵產HA的量以及相對分子量方面有很大的差別,尤其是獲得高分子量的HA高產菌株是急需解決的問題。一般通過物理、化學誘變可以獲得比較理想的菌株。

傳統的誘變選育多是依靠化學或者物理單一誘變或者化學與物理的復合誘變,很少有采用生理脅迫培養與復合誘變聯合選育菌株的報道。周曉惠[3]等通過在發酵液中添加溶菌酶作為脅迫手段提高了HA的分子量。管世敏[4]等研究了氧化劑NaClO脅迫培養獸疫鏈球菌對HA分子量的影響,結果表明HA的分子量得到了提高。有研究稱培養基中氧化劑H2O2的存在會促進鏈球菌分泌更多的HA,同時HA分子量也會有所提高[5]。HA是鏈球菌用來抵御外界環境傷害的重要屏障。當菌體生長的環境有H2O2的存在時,細胞會加強HA的分泌,通過增加細胞外莢膜的厚度與黏度來保護自我。黃金明[6]等通過LiCl結合紫外(Ultraviolet)及硫酸二乙酯(Diethyl Sulfate)進行復合誘變選育出了一株高產量、高分子量的菌株。因此本實驗以馬疫鏈球菌MF003為出發菌,首先通過對菌株進行H2O2氧化脅迫培養,篩選抵抗能力較強的菌株,再對優選菌株進行紫外、硫酸二乙酯復合誘變,從中再度篩選產量、相對分子量高的菌株。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

紫外可見分光光度計UV-6000 上海元析儀器有限公司;高速冷凍離心機GL-21M 上海盧湘儀離心機儀器有限公司;發酵罐BIOFLO3000 NEW BRONSWICK SCIENTIFIC;烏氏粘度計D01002-025 上海笛柏實驗設備有限公司。

馬疫鏈球菌MF003 本實驗室保存。

固體培養基 心腦浸粉(國產,北京陸橋技術有限責任公司)3.7%,酵母粉1%,葡萄糖0.1%,瓊脂粉2%,MgSO4·7H2O20.2%。調節pH至7.0,121℃滅菌15min。

種子培養基 葡萄糖2%,酵母粉2%,MgSO4·7H2O20.2%,KH2PO40.2%,Na2HPO40.1%。調節pH至7.0,121℃滅菌15min。

發酵培養基 葡萄糖5%,酵母粉2%,MgSO4·7H2O20.2%,K2SO40.2%,NaH2PO40.6%。調節pH至7.0,121℃滅菌15min。

透明質酸鈉鹽篩選培養基 在上述固體培養基冷卻至50～60℃時加入0.1%的透明質酸鈉。

1.2 實驗方法

1.2.1 菌懸液制備 參考文獻[7]，將種子培養基接種,于37℃,200r/min培養16～18h后6000r/min離心10min,分別用等體積的無菌生理鹽水和pH7.0的磷酸緩沖液洗滌2次,之后重新懸浮于生理鹽水和pH7.0的磷酸緩沖液中。搖勻后倒入裝有滅菌玻璃珠的100mL的三角瓶中(玻璃珠的數量與13mL液面齊平為宜)130r/min振蕩10min,制成單菌懸液,調整細胞濃度108/mL,OD600為0.75左右。其中pH7.0的磷酸緩沖液菌懸液用于DES誘變,生理鹽水菌懸液用于紫外誘變與氧化脅迫培養。

1.2.2 氧化脅迫培養 參考文獻[5,8]，吸取100μL濃度為0.1%、0.2%、0.3%的H2O2溶液均勻涂布于透明質酸鈉鹽篩選培養基上,每個條件重復3次。將原始菌株菌懸液稀釋一定的倍數后,吸取100μL涂布于透明質酸鈉鹽篩選培養基上,37℃培養48h。

1.2.3 紫外誘變 參考文獻[9]，將1.2.2選擇的菌株作為出發菌制備生理鹽水菌懸液進行紫外誘變。20W紫外燈預熱30min。取8mL菌懸液于直徑為9cm的培養皿內,培養皿內裝有滅菌攪拌子。將培養皿放在離紫外燈30cm處的磁力攪拌器上,打開紫外燈的同時,打開磁力攪拌器,分別照受20、30、40、50、60s。每個條件重復3次。將照受后的和未照受的菌懸液在暗處稀釋涂透明質酸鈉鹽篩選培養基,37℃培養48h后進行初篩和復篩。

1.2.4 DES誘變 參考文獻[10]，將1.2.2選擇的菌株作為出發菌制備磷酸緩沖液菌懸液進行DES誘變。

DES誘變劑的配制:取0.5mL的DES原液置于無菌三角瓶中,用0.5mL的無水乙醇溶解,加入19mL pH7.0的磷酸緩沖液,充分振蕩,立即使用。方法:取10mL菌懸液注入三角瓶中,加入DES誘變劑0.2mL,充分混勻后水浴37℃,50r/min振蕩40、50、60、70、80、90min。每個條件重復3次。振蕩后加0.5mL 25%硫代硫酸鈉溶液中止反應,將DES處理后的和未處理的菌懸液稀釋涂透明質酸鈉鹽篩選培養基,37℃培養48h后進行初篩和復篩。

1.2.5 UV、DES復合誘變 將1.2.3紫外誘變后得到的較優的菌株作為出發菌進行DES化學誘變。將第一次復合誘變得到的較優菌株再反復進行UV、DES復合誘變。

1.2.6 致死率計算 致死率(%)=(未處理過的平板菌落數-處理過的平板菌落數)/未處理過的平板菌落數×100。致死率一般選擇80%～90%之間。

1.2.7 菌種初篩 在透明質酸鈉鹽篩選培養基上測量單個菌落的透明圈與直徑比(HC)[11],與出發菌作對照。選擇HC值小的菌株保存斜面,進行復篩。

1.2.8 菌種復篩 原始菌株與初篩后保存的菌株分別用接種環接三環于50mL發酵培養基的250mL規格的三角瓶中,37℃,200r/min搖床培養。48h測HA的產量及其相對分子量。

1.2.9 突變菌株的傳代穩定性實驗 參考文獻[9]，將突變菌株接到固體培養基上進行培養以此作為第1代,將1代菌株再轉接到種子培養基中以此作為第2代;重復上述步驟直到第10代。將每代菌株進行搖瓶實驗測產量與分子量。

1.2.10 樣品HA的含量測定 取發酵液1mL,加入3倍體積的無水乙醇,混勻后4℃靜置1h,4000r/min離心10min。沉淀重新溶解于0.9%的NaCl溶液中。采用硫酸咔唑法[12]測定HA含量。

1.2.11 樣品HA的相對分子量測定 取一定體積的發酵液,加入3倍體積的95%的乙醇,靜置沉淀。重新溶解于0.9%的NaCl溶液中,用2μm的微孔濾膜抽濾,再用2倍體積95%的乙醇醇沉,沉淀用無水乙醇脫水再真空干燥,得HA粗品。

將一定量HA粗品溶解之后,用硫酸咔唑法測定HA溶液濃度計算出樣品HA的純度,然后再稱取一定量的粗品HA溶解于適當量的0.9% NaCl溶液中,配成0.2g/L[13]濃度的HA溶液作為待測液。

采用Laurent[14]法測定HA的相對分子量。采用內徑為0.54mm的烏氏粘度計于25℃測定黏度,參比液為0.9%的NaCl溶液。根據公式計算特性黏數:

[η]=lnηr/c,公式中ηr為T/T0,c為供試液濃度g/mL。其中T為參比液流出時間,T0為供試液流出時間。

根據公式[η]=0.036Mr0.78,計算出HA的平均分子量Mr。

2 結果與討論

2.1 H2O2氧化脅迫培養菌株篩選

按照1.2.2的方法進行氧化脅迫培養。結果如表1所示,當H2O2的濃度在0.2%的時候,致死率達到了89.0%,從存活的菌株當中挑取HC值小的50株斜面保存。原始菌株的產量經過搖瓶實驗穩定在0.73g/L左右。保存的50株菌株經過搖瓶實驗發現大部分的菌株的產量相對于原始菌株都有一定的提升,其中較優的一株H-6經過搖瓶實驗產量穩定在0.87g/L,相對于原始菌株提高了19.2%。其中相對分子量與原始菌株相差不大,都為1.35×106D左右。實驗結果表明通過H2O2氧化脅迫培養,產量較低的菌株無法存活,而產量較高的菌株能存活可能是由于當菌株在有H2O2的環境中生長時,細胞通過分泌更多的HA來降低氧自由基的進入,從而降低活性氧對細胞的傷害[15-16]。

表1 平板菌落數Table 1 Flat number of colonies

2.2 紫外誘變菌株篩選

按照1.2.3的方法對2.1篩出的菌株H-6進行紫外誘變。結果如圖1所示,照受時間在50s時,致死率為92.3%,照受時間為60s時致死率接近100%,因此選擇照受時間50s為最佳時間。

圖1 紫外誘變的致死曲線Fig.1 Fatality rate curve in UV mutation

將在此條件下得到的菌株選取50株進行初篩,挑取HC值較小的10株菌株,測定HA的含量和相對分子量,結果如表2所示。大部分突變菌株相對于原始菌株在產量與相對分子量方面都有一定的提高。選擇一株較優的突變菌株Z-15,其產量為1.04g/L,相對于原始菌株提高了42.5%。相對分子量為1.67×106u,相對于原始菌株提高了23.7%。同時Z-15突變株可以作為下一步復合誘變的出發菌株。

表2 經紫外誘變后突變株的復篩結果Table 2 Further selection of high hyaluronic acid-producing strain by UV mutation

2.3 DSE誘變菌株篩選

按照1.2.4的方法對2.1篩出的菌株H-6進行DES誘變。結果如圖2所示,DES處理時間在80min時致死率為85.3%,處理時間為90min時致死率接近100%,因此選擇處理時間為80min為最佳處理時間。

圖2 DES誘變的致死曲線Fig.2 Fatality rate curve in diethyl sulfate mutation

將在此條件下得到的菌株選取50株進行初篩,挑取HC值較小的十株菌株,測定HA的含量和相對分子量,結果如表3所示。突變菌株的產量跟相對分子量都有提高,其中突變菌株D-16的結果更好,其產量達到1.20g/L,相對于原始菌株提高了64.4%。相對分子量為1.75×106u,相對于原始菌株提高了29.6%。

2.4 UV、DES復合誘變菌株篩選

一般認為復合誘變具有協同作用,誘變效果要好于單一的誘變。復合誘變的致死率也是以80%～90%為宜。以紫外誘變突變菌株Z-15為出發菌,按照1.2.4的方法進行DES誘變,挑選HC值小的菌株再次進行UV與DES復合誘變,如此反復復合誘變10次。

將復合誘變的突變菌株進行初篩,部分平板實驗結果如圖3、圖4所示,由圖可以看出,出發菌株MF0039(圖3),其在生長過程中產生大量的透明質酸酶,菌株周圍的透明圈較大。而通過復合誘變后的菌株周圍的透明圈大小有較大差異,其中一株較優良的菌株ZD-25(圖4)周圍基本沒有透明圈出現。

表3 經DES誘變后突變株的復篩結果Table 3 Further selection of high hyaluronic acid-producing strain by diethyl sulfate mutation

圖3 出發菌株MF003Fig.3 Original strain MF003

圖4 復合誘變后的菌株Fig.4 Compound mutagenized strain

通過比較HC值大小,選擇10株HC值較小的突變菌株進行進一步復篩,其結果如表4。經過初篩與復篩得到較優菌株ZD-25,其產量達到1.61g/L,相對于原始菌株提高了120.5%,相對分子量為2.13×106u,相對于原始菌株提高了57.8%。相對于Z-15,D-16突變株其產量與相對分子量均有所提高。因此選用ZD-25為復合誘變后的較優菌株。

2.5 ZD-25突變菌株的遺傳穩定性

獲得傳代穩定的突變菌株也是誘變選育的目的之一,因此將突變菌株ZD-25進行10次的連續傳代,每次均進行產量和相對分子量的測定。結果如圖5所示。HA的產量、相對分子量基本維持在1.61g/L、2.13×106u左右。從第9代開始透明質酸的產量與相對分子量開始出現輕微的下降,但HA的產量和相對分子量的下降均在10%以內[17],因此總體上菌株還處于穩定狀態。

表4 復合誘變后突變株的復篩結果Table 4 Further selection of high hyaluronic acid-producing strain by compound mutation

圖5 突變株ZD-25遺傳穩定性Fig.5 Genetic stability of ZD-25

2.6 初步5L發酵罐實驗結果

將原始菌株與ZD-25菌株分別進行5L發酵罐初步實驗。將種子液培養16h之后,按照10%的接種量無菌操作加入發酵培養基中,一共3.6L?；緟?溫度37℃,轉速200r/min,pH控制在7.2,通氣量3.6L/min。每隔4h取一次樣,在第10h補加20g/L的糖液,測量HA的含量與相對分子量。結果如圖6所示,突變株ZD-25的HA產量與相對分子量分別達到了4.26g/L,2.90×106u,分別比原始菌株的1.60g/L,1.50×106u提高了166.3%,93.3%。本實驗室后期會對突變株ZD-25的發酵條件進一步優化。

圖6 原始菌株與突變菌株ZD-25發酵曲線Fig.6 Fermentation diagram of original strain and mutant strain ZD-25

3 結論

實驗開始先以H2O2作為篩選條件,對菌株MF003進行氧化脅迫培養,再以紫外、DES單獨誘變,結果顯示經過氧化脅迫培養后的HA在產量上有一定的提高,經過紫外、DES單獨誘變之后,透明質酸的產量與相對分子量都有一定的提高。為了進一步選擇高產菌株,因此下一步選擇了以UV與DES的復合誘變,結果顯示復合誘變相對于單一的誘變還是具有明顯的優勢的,這可能是由于復合誘變具有協同效應,能很好的對菌株進行誘變選育。經過搖瓶發酵得到的突變菌株ZD-25的產量達到1.61g/L,相對于原始菌株搖瓶發酵提高了120.5%。相對分子量為2.13×106u,相對于原始菌株提高了57.8%。經過10次的傳代,仍能保持遺傳穩定。說明H2O2氧化脅迫培養與復合誘變相結合的方法能提高突變幾率降低回復突變率,得到良好的菌株。通過5L的發酵罐初步發酵,突變株ZD-25的HA產量達到了4.26g/L,相對分子量達到了2.90×106u,分別比原始菌株發酵罐發酵提高了166.3%,93.3%。

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Oxidative stress and UV,DES compound mutation screening of high molecular weight and high-yield hyaluronic acid strain

TANG Dong,RONG Shao-feng*,GUAN Shi-min,LI Qian-qian,WANG Jing-wen

(School of Perfume and Aroma Technology,Shanghai Institute of Technology,Shanghai 201418,China)

StreptococcusequinesMF003 was used as an original strain to perform H2O2oxidative stress culture,ultraviolet radiation(UV)and diethyl sulfate(DES)compound mutation. After screening,a hyaluronidase deficient strain ZD-25 with high molecular weight and high-yield of hyaluronic acid was achieved. Based on shake flask fermentation,the yield of hyaluronic acid reached to 1.61g/L and relative molecular weight of 2.13×106u. Compared to the original strain,the yield and relative molecular weight were increased by 120.5% and 57.8%,respectively. The production and relative molecular weight of hyaluronic acid maintained high stability after several generation of reproduction. Furthermore,the yield of hyaluronic acid in mutant ZD-25 reached to 4.26g/L and relative molecular weight of 2.90×106u by 5L fermentation tank initial fermentation. Compared to the original strain,the yield and relative molecular weight increased 166.3% and 93.3%,respectively.

oxidative stress;compound mutation;hyaluronic acid;streptococcusequines

2014-08-08

湯棟(1989-),男,在讀碩士,研究方向:生物發酵與提取。

*通訊作者:榮紹豐(1969-),男,博士,教授,研究方向:天然香料與醫藥產品的生物技術研究。

上海市科委產學研醫項目(11DZ1921405);上海市產學研合作年度計劃(滬CXY-2013-78);上海應用技術學院引進人才科研啟動項目(YJ2013-23)。

TS205

A

1002-0306(2015)11-0136-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.11.019