綠茶多糖的乙酰化修飾及其清除自由基、活性的研究

梁少茹,肖 霄,肖 斌,*

(1.西北農林科技大學園藝學院 ,陜西楊陵 712100;2.北京林業大學林木生物質化學北京市重點實驗室 ,北京 100083)

梁少茹1,肖 霄2,肖 斌1,*

(1.西北農林科技大學園藝學院 ,陜西楊陵 712100;2.北京林業大學林木生物質化學北京市重點實驗室 ,北京 100083)

綠茶多糖,乙酰化,自由基,亞硝基,清除活性

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

綠茶 來自西北農林科技大學茶葉實驗站;無水乙醇、95%乙醇、氯仿、正丁醇、乙醚、丙酮、氫氧化鈉、過氧化氫、乙酸酐、鄰二氮菲、鄰苯三酚、無水對氨基苯磺酸、鹽酸萘乙二胺、硫酸亞鐵、亞硝酸鈉、鹽酸羥胺、檸檬酸、檸檬酸鈉、磷酸二氫鉀、醋酸鈉等試劑均為國產分析純。

AL-204分析天平電子天平 梅特勒-托利多(上海)儀器有限公司;UV3802準雙光束紫外可見分光光度計 上海尤尼柯儀器有限公司;SHB-Ⅲ循環水式多用真空泵 鄭州長城科工貿有限公司;RE-52AA旋轉蒸發儀 上海亞榮生化儀器廠;DK-S26型電熱恒溫水浴鍋 上海森信實驗儀器有限公司;TGL-18M高速冷凍離心機 上海盧湘儀離心機儀器有限公司等。

1.2 實驗方法

1.2.1 綠茶多糖的提取與純化 綠茶多糖的提取與純化方法[10-11]如下:綠茶茶葉粉碎,過30目篩,按茶水比1∶20在55℃下水浸提2.5h,趁熱過濾,55℃溫度條件下減壓濃縮至原體積的三分之一,加入3倍體積95%乙醇沉淀,沉淀物用丙酮、無水乙醇、乙醚交替洗滌3次,經Sevag 法脫蛋白、過氧化氫脫色,再經透析后凍干即為純化茶多糖(TPS)。

1.2.2 茶多糖的乙酰化修飾及最佳修飾條件確定 茶多糖乙酰化修飾方法[8]如下:取綠茶多糖樣品0.5g加入到10mL蒸餾水中并混勻,用0.5mol/L氫氧化鈉調pH為9.0,一定溫度(20～40℃)保溫,其間交替向溶液中加入一定量的乙酸酐和0.5mol/L的氫氧化鈉以保持溶液pH為8.0。反應期間溫度控制在20～40℃,乙酸酐加入量為10～20mL,保溫時間為3～5h。反應結束后,用5mol/L鹽酸調整溶液的pH為7.0,冷卻后將混合液置于透析袋中流水透析3d,再經減壓濃縮、醇沉、冷凍干燥后即得乙酰化茶多糖(Acetylated tea polysaccharides,A-TPS)。乙酰化多糖的取代度采用堿性羥胺比色法[12]進行測定,先繪制乙酰基濃度與其吸光度(A=540nm)的標準曲線,測出樣品中乙酰基含量,然后計算取代度。取代度計算公式:

式中,W為茶多糖中乙酰基含量。

通過分析比較,保溫時間(A)、茶多糖與乙酸酐的體積比(B)、反應溫度(C)是影響反應進程的主要因素[13],以取代度為指標,通過單因素實驗對各因素進行考察,得出各因素水平取值。選擇這3個指標作為實驗三因素,設計三因素三水平的正交實驗,參照上述乙酰化茶多糖修飾方法,按L9(34)正交表進行實驗,研究得到最高取代度乙酰化茶多糖的反應條件。正交實驗因素水平表見表1。

表1 因素水平表Table 1 Factors and levels

超氧陰離子清除率=(A0-A1)/A0×100%

式中,A0為對照組吸光值,A1為樣品組吸光值。

1.2.4 茶多糖及其乙酰化產物清除羥自由基(·OH)活性的測定 茶多糖及其乙酰化產物清除·OH活性的測定采用鄰二氮菲-Fe氧化法[15]進行:精確移取5mmol/L鄰二氮菲溶液(用蒸餾水將50mmol/L鄰二氮菲無水乙醇溶液稀釋制得)1.5mL,加入50mmol/L pH7.4磷酸緩沖液2.0mL,充分混勻,滴加1.0mL 7.5mmol/L FeSO4溶液,加好后立即混勻,分別加1mL不同濃度(0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mg/mL)茶多糖或其乙酰化產物溶液,最后加0.1% H2O21.0mL啟動反應,以水補充體積至10mL作為樣品管,損傷管中加H2O2不加樣品溶液,未損傷管兩者均不加,損傷管、未損傷管均以水補充體積至10mL,各管反應液均置于37℃保溫60min,取出后在波長536nm處測吸光值。根據下式計算羥自由基清除率:

羥自由基清除率=(A2-A1)/(A0-A1)×100%

式中,A0為未損傷管吸光值,A1為損傷管吸光值,A2為樣品管吸光值。

1.2.6 數據處理 正交實驗結果分析用Minitab15進行分析,使用SPSS statistics 19進行顯著性分析,文中其他圖表使用EXCEL完成。

2 結果與分析

2.1 乙酰化茶多糖的合成制備及修飾條件的優化

水提醇沉法提取綠茶多糖得粗茶多糖提取率為2.07%,經過脫色和6次除蛋白得到初步純化茶多糖。以保溫時間(A)、茶多糖質量與乙酸酐體積比(B)、反應溫度(C)作為實驗三因素,以制得的純化多糖為原料,參照表1各因素水平進行正交實驗。表2為實驗因素水平表和正交實驗結果及極差分析表,正交實驗重復三次,表2中取代度為三次實驗平均值。

表2 正交實驗結果及極差分析表Table 2 Results of orthogonal test and range analysis

由表2可知,三個實驗因素對取代度的影響作用由大到小依次為:茶多糖質量與乙酸酐體積比(B)>保溫時間(A)>反應溫度(C),正交實驗得到的最適條件為茶多糖質量與乙酸酐體積比為1∶40,保溫時間4h,反應溫度為30℃。在最優條件下進行驗證實驗,制得乙酰化茶多糖的取代度為0.337,表明該優選條件穩定可行,重復性良好。以該正交實驗獲得的最佳反應條件制取乙酰化茶多糖,并進行以下清除自由基及亞硝基的實驗。

圖1 茶多糖與乙酰化茶多糖 對超氧陰離子自由基的清除作用Fig.1 Superoxide anion free radical scavenging effect of TPS and acetylated TPS

2.3 茶多糖及乙酰化茶多糖對羥自由基(·OH)的清除作用

羥自由基是一種氧化活性很強的氧化劑,可直接損傷各種生物膜,導致多種疾病的發生,·OH清除率是抗氧化作用的重要指標[3]。本實驗采用鄰二氮菲-Fe氧化法測定綠茶多糖及其乙酰化產物對·OH的清除作用,實驗結果見圖2。

圖2 綠茶多糖與乙酰化綠茶多糖對羥自由基的清除作用Fig.2 Hydroxyl free radical scavenging effect of TPS and acetylated TPS

由圖2可知,茶多糖及其乙酰化產物對·OH的清除作用與溶液濃度正相關,且乙酰化茶多糖清除活性均高于未修飾前,·OH清除活性最大提高率達36.96%。此外,當溶液濃度為本實驗范圍內最大即1mg/mL時,乙酰化茶多糖的·OH清除率達到最大值60.36%,說明乙酰化茶多糖具有較強的·OH清除活性，表明乙酰化修飾能夠有效地提高茶多糖對·OH的清除活性。

圖3 綠茶多糖與乙酰化綠茶多糖對亞硝基的清除作用Fig. scavenging effect of TPS and acetylated TPS

圖4 乙酰化修飾茶多糖取代度與清除活性的關系Fig.4 Relationship between modification degree and scavenging effect of acetylated tea polysaccharides

3 討論

4 結論

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LIANG Shao-ru1,XIAO Xiao2,XIAO Bin1，*

(1.College of Horticulture,Northwest A&F University,Yangling 712100,China;2.Beijing Key Laboratory of Lignocellulosic Chemistry,Beijing Forestry University,Beijing 100083,China)

2014-09-09

梁少茹(1987-)，女，碩士研究生，研究方向：茶葉生物化學。

*通訊作者:肖斌(1957-)，男，學士，教授，主要從事茶葉生理生態及茶葉生物化學研究。

國家茶葉產業技術體系(CARS-23)；陜西省科技統籌工程計劃難題招標(2013KTZB02-01-01)。

TS201.2

A

1002-0306(2015)11-0084-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.11.009