杜仲雄花乙酸乙酯提取物的抑菌活性研究

李 欣,喬家駒,馮漢青,張 敏,關隨霞,劉少陽,張素玲

(1.河南科技大學食品與生物工程學院,河南洛陽 471023;2.西北師范大學生命科學學院,甘肅蘭州 730070;3.漯河醫學高等專科學校食品工程系,河南漯河 462000)

杜仲雄花乙酸乙酯提取物的抑菌活性研究

李 欣1,喬家駒1,馮漢青2,張 敏1,關隨霞1,劉少陽3,張素玲1

(1.河南科技大學食品與生物工程學院,河南洛陽 471023;2.西北師范大學生命科學學院,甘肅蘭州 730070;3.漯河醫學高等專科學校食品工程系,河南漯河 462000)

本實驗以杜仲雄花為材料,通過打孔法和倍比稀釋法,探討杜仲雄花乙酸乙酯提取物及經過硅膠柱分離得到的六種不同極性提取物對真菌和細菌的抑菌活性,并確定最小抑菌濃度(MIC)。結果顯示:杜仲雄花乙酸乙酯提取物對供試金黃色葡萄球菌、炭疽桿菌、枯草芽孢桿菌、大腸桿菌和黑曲霉均有較好的抑制效果,最小抑菌濃度(MIC)分別為0.0156、0.0156、0.0313、0.0313、0.1250g/mL,對根霉和青霉沒有抑制作用。而分離得到的六種提取物按極性不同分別為10%甲醇洗脫所得樣品、20%甲醇洗脫所得樣品、30%甲醇洗脫所得樣品、純甲醇洗脫所得樣品、純甲醇含氨洗脫所得樣品和水洗脫所得樣品,其中10%甲醇洗脫所得樣品、20%甲醇洗脫所得樣品與乙酸乙酯提取物活性相似或有增強,30%甲醇洗脫所得樣品、純甲醇洗脫所得樣品對部分細菌有抑制作用,而只有水洗脫所得樣品對根霉有抑菌作用。說明杜仲雄花乙酸乙酯提取物和進一步的硅膠柱分離得到的不同極性提取物具有良好的抑菌活性,且硅膠柱的分離能得到更佳的抑菌活性提取物,為杜仲雄花的進一步開發提供依據。

杜仲雄花,乙酸乙酯提取物,抑菌圈,活性

杜仲是中國特有的杜仲科杜仲屬植物,杜仲皮作為中草藥已有兩千年歷史。在過去的20年,杜仲作為藥用植物和保健品風靡中國和日本[1]。杜仲的主要活性成分為脂素類、環烯醚萜類、黃酮類化合物[2],其主要的藥理學活性有降血壓[3]、抗腫瘤[4]、抗氧化[5]、抗病毒[6]、抗菌[7]、消炎[8]作用。但是對杜仲的活性研究主要集中在皮和葉子部分,對雄花研究的還很少。本實驗室前期結果顯示,與杜仲葉相比,杜仲雄花具有更高的鎮靜催眠活性,且乙酸乙酯提取物是主要的活性組分。但杜仲的抑菌活性是否也集中在乙酸乙酯組分,還未見報道[10-13]。細菌對環境、人類和動物都有危害,據世界衛生組織調查,全球50%的死亡率是由傳染病引發的[14]。在植物中,細菌導致葉斑病、火疫病和萎蔫。同時霉菌是危害飼料的主要生物性污染源[15-17]。本實驗以杜仲雄花為實驗材料,研究其乙酸乙酯提取物及其分離物的抑菌活性,本研究將為新型天然抑菌劑的開發以及杜仲的深入利用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

杜仲(EucommiaulmoidesOliv.)雄花(采自洛陽市汝陽縣王坪鄉杜仲種植基地),將杜仲雄花除雜,在低溫(45℃)條件下干燥10h,含水量在6%～8%,用粉碎機粉碎,過40目篩,置于0～4℃冰箱中保存,備用。

細菌菌種:大腸桿菌(Escherichiacoli)、枯草芽孢桿菌(Bacilllussubtilis)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、炭疽桿菌(Bacillusanthraci);霉菌菌種:根霉(Rhizopus)、青霉(Pseudomonassp)、黑曲霉(Aspergillusniger),以上供試菌種均有河南科技大學食品與生物工程學院實驗中心提供。

乙醇、石油醚、乙酸乙酯、氯仿、甲醇(以上均為分析純) 上海試一化學試劑有限公司;柱層析硅膠(試劑級)青島勝海精細硅膠化工有限公司;硅膠板 青島硅海精細硅膠化工有限公司。

細菌采用牛肉膏蛋白胨培養基;霉菌采用馬鈴薯培養基。

RE-52A型旋轉蒸發儀 上海亞榮生化儀器廠;SHB-Ⅲ循環水式真空泵 鄭州杜甫儀器廠;BS210S型萬分之一電子分析天平 北京賽多利斯天平有限公司;DHG-9240A型電熱鼓風干燥箱 上海一恒科學儀器有限公司;SW-CJ-IF單人雙面無菌操作臺 蘇州凈化設備有限公司;恒溫培養箱 江蘇省金壇市亞榮醫療器械廠;立式壓力蒸汽滅菌器 上海申安醫療器械廠。

1.2 實驗方法

1.2.1 杜仲雄花提取物的制備 在李欣等前期工作的基礎上改進方案[18],將在不同月份不同方向采摘的杜仲雄花烘干并混合均勻。精確稱取25g干燥的杜仲雄花,置于500mL圓底燒瓶,采用63℃、3h、60%乙醇、料液比1∶10回流提取,用石油醚處理除去葉綠素及脂質后,采用51℃、53h、料液比1∶10乙酸乙酯回流提取,過濾提取液,干燥至恒重得杜仲雄花乙酸乙酯提取物。

乙酸乙酯提取物樣品上硅膠柱,采用氯仿-甲醇系統和梯度洗脫,極性變化如下(按混合洗脫劑中甲醇的含量由小到大標示):甲醇10%、甲醇20%、甲醇30%、純甲醇、純甲醇含氨、水,分別為樣品1、2、3、4、5、6。用無菌蒸餾水稀釋配制成0.5g/mL(C1)、0.25g/mL(C2)、0.125g/mL(C3)3組濃度系列的7組藥液,備用。

1.2.2 菌種活化及菌懸液的制備 實驗所用菌株使用前先采用劃線法接種于平板上,細菌37℃培養24h,真菌28℃培養48h后,挑選典型菌落接種于液體培養基中,在適宜條件下培養待液體培養基變渾濁后,用無菌生理鹽水配制成含菌量為1×108～2×108cfu/mL的菌懸液,備用。

1.2.3 抑菌活性測定 采用平板打孔法檢測藥物對實驗用菌的作用效果。在含菌平板上打孔2個,于每孔中各自加入不同種及不同濃度的供試藥物0.05mL,待其擴散完全放入培養箱中在適宜溫度下培養一定時間(細菌37℃,12h;霉菌28℃,48h)后,用游標卡尺測量抑菌圈的大小,取其平均值作為測定結果。

1.2.4 最低抑菌濃度(MIC)的測定 采用試管稀釋法(二倍稀釋法),然后在每管內加入20μL菌原液(各管最終含菌量為106～107cfu/mL)。在適宜溫度下培養(細菌37℃,12h;霉菌28℃,48h),以渾濁度為指標檢查試管中有無供試菌的生長。以肉眼觀察,不顯示渾濁、供試菌未生長的那一管藥液稀釋度作為MIC。

1.3 統計學分析

用SPSS 11.5進行統計學分析。獨立樣本間的差異顯著性分析用Nonparametric Tests,包括Mann-Whitney Test、Moses Test、Two-Sample Kolmogorov-Smirnov Test 和Wald-Wolfowitz Test。T檢驗判定檢驗結果:p>0.05,不顯著;p≤0.05,顯著;p≤0.01,極顯著。

2 結果與分析

2.1 杜仲雄花乙酸乙酯提取物的抑菌效果

乙酸乙酯提取物各樣品不同濃度對各供試菌株抑制效果見表1。

表1 各樣品抑菌圈直徑Table 1 Antimicrobial test results of different samples

注:表中數據為抑菌圈直徑,單位為mm,“-”表示沒有抑菌作用。C1:0.5g/mL,C2:0.25g/mL,C3:0.125g/mL。結果表明各樣品對各供試菌株的抑制作用顯示出計量相關性。

Tukey B test的結果顯示,乙酸乙酯提取物濃度為0.125g/mL時,對金黃色葡萄球菌、炭疽桿菌、枯草芽孢桿菌和大腸桿菌抑菌作用,其抑菌圈直徑>15mm;與黑曲霉相比,差異極顯著(p<0.01),提取物對黑曲霉也有一定的抑制作用,其抑菌圈直徑為7mm;其對根霉和青霉沒有抑制作用。

濃度為0.125g/mL,樣品1和樣品2同樣品3相比,對金黃色葡萄球菌的抑菌作用差異顯著(p<0.01);樣品1、樣品2和樣品3同樣品4相比,對炭疽桿菌的抑菌作用差異顯著(p<0.01)。

乙酸乙酯提取物的6種初分物(樣品1～6)的抑菌活性實驗表明,主要具有抑菌活性的物質集中在樣品1和樣品2中,并且對金黃色葡萄球菌、炭疽桿菌和枯草芽孢桿菌具有較好的抑制作用,其對金黃色葡萄球菌和炭疽桿菌(樣品1濃度為0.5、0.25mg/mL;樣品2濃度0.5mg/mL)抑菌圈直徑>20mm。與此前對菊芋葉片提取物的研究相似,其活性較強的抑菌化合物主要集中在乙酸乙酯提取物中[19]。綠原酸是杜仲中主要的抑菌活性成分[20],本文得到的杜仲乙酸乙酯提取物及其初分物的有效成分是否是綠原酸,還有待進一步的工作。

實驗中金黃色葡萄球菌、炭疽桿菌和枯草芽孢桿菌均屬于革蘭氏陽性菌,因此猜測樣品1和樣品2對革蘭氏陽性菌抑制作用較佳,這可能與革蘭氏陽性菌細胞壁結構簡單,藥液容易滲透有關,其抑菌機制可能為藥物對細胞壁、細胞膜完整性的破壞,但此推論需要進一步實驗的證實。

樣品3在濃度為0.125g/mL時,對炭疽桿菌的抑菌作用,與金黃色葡萄球菌和大腸桿菌相比,差異極顯著(p<0.01)。

乙酸乙酯提取物、樣品1、樣品2和樣品3對金黃色葡萄球、炭疽桿菌、枯草芽孢桿菌和大腸桿菌(細菌)的抑菌作用同對根霉、黑曲霉和青霉(霉菌)作用相比差異顯著,原因可能分離出的物質針對細菌抑菌,與細菌和真菌的結構特點相關。

樣品5對7種供試菌株均無抑制作用,只有樣品6對根霉具有一定的抑制作用,說明采用柱層析的方法可以起到分離的效果,使同類活性物質集中,而此實驗將對根霉具有抑制作用的有效成分集中在水洗脫的極性相對較大的組分中。同時乙酸乙酯提取物本身沒有顯示出對根霉的抑菌活性,而其硅膠柱層析分段分離組分樣品6表現出對根霉的抑菌活性,說明柱層析的分離方法是分離純化天然產物生物活性成分的有效手段。水是極性較強的溶劑,與其他溶劑相比,水提取物的抑菌作用相對弱,初步說明一些抑菌成分的極性為中等極性。

2.2 杜仲雄花乙酸乙酯提取物對供試菌的最小抑菌濃度的測定

表2 各樣品的最小抑菌濃度Table 2 MIC of different samples(g/mL)

注:表中“-”號表示其MIC>0.5g/mL。最小抑菌濃度測定結果見表2。由表2可知,乙酸乙酯提取物對供試菌的MIC由小到大依次為:金黃色葡萄球，炭疽桿菌<枯草芽孢桿菌，大腸桿菌<黑曲霉。進一步說明乙酸乙酯提取物對金黃色葡萄球菌和炭疽桿菌的抑菌效果更強;樣品1對供試菌的MIC由小到大依次為:金黃色葡萄球,炭疽桿菌<枯草芽孢桿菌<大腸桿菌,黑曲霉。樣品2對供試菌的MIC由小到大依次為:炭疽桿菌<金黃色葡萄球<枯草芽孢桿菌<黑曲霉<大腸桿菌。經過進一步分離,樣品2的結果顯示出對炭疽桿菌更強的抑菌效果。樣品3對供試菌的MIC由小到大依次為:炭疽桿菌<金黃色葡萄球,大腸桿菌。樣品4僅對炭疽桿菌有抑制作用,MIC為0.0625g/mL。樣品6對供試菌的MIC由小到大依次為:金黃色葡萄球<炭疽桿菌，根霉,黑曲霉。不同極性的提取物對不同菌株的最小抑菌濃度順序不同,顯示通過柱層析進一步的分離乙酸乙酯提取物,能夠篩選出針對不同病原菌的有效提取物,從而開發出有針對性的抑菌藥物。

3 結論與討論

抑菌性方面10%甲醇洗脫所得樣品、20%甲醇洗脫所得樣品與乙酸乙酯提取物活性相似或有增強,30%甲醇洗脫所得樣品、純甲醇洗脫所得樣品對部分細菌有抑制作用,而只有水洗脫所得樣品對根霉有抑菌作用。而在最小抑菌濃度(MIC)方面,杜仲雄花乙酸乙酯提取物對供試金黃色葡萄球菌、炭疽桿菌、枯草芽孢桿菌、大腸桿菌和黑曲霉均有較好的抑制效果,最小抑菌濃度(MIC)分別為0.0156、0.0156、0.0313、0.0313、0.1250g/mL,對根霉和青霉沒有抑制作用。

通過對杜仲雄花乙酸乙酯抑菌實驗結果判斷,其結果可作為藥效學的初步判斷依據。本實驗對杜仲乙酸乙酯提取物的分離及其抑菌活性分析,將有利于開發專一性抗菌類食品添加劑及抗菌藥物。天然藥物活性成分的提取及活性鑒定對中藥現代化、新藥的開發研究意義重大,本實驗基于此前提進行了初步研究,以供參考。

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Study on antibacterial activities of the ethyl acetate extract in maleEucommiaflowers

LI Xin1,QIAO Jia-ju1,FENG Han-qing2,ZHANG Min1,GUAN Sui-xia1,LIU Shao-yang3,ZHANG Su-ling1

(1.College of Food and Bioengineering,Henan University of Science and Technology,Luoyang 471023,China;2.College of Life Science,Northwest Normal University,Lanzhou 730070,China;3.Food Engineering Department,Luohe Medical Collage,Luohe 462000,China)

In this study,extract of maleEucommiaflowers was obtained by ethyl acetate. Six different polar extracts were further isolated from ethyl acetate extract ofEucommiaby silica gel column chromatography. This study was conducted to investigate the antibacterial activities of these seven extract by using punch method or dilution method. Minimal inhibitory concentration(MIC)of extracts was also determined. Results showed that ethyl acetate extract had good antibacterial activities againstStaphylococcusaureus,Bacillusanthracis,Bacillussubtilis,EscherichiacoliandAspergillusniger. The MIC was 0.0156,0.0156,0.0313,0.0313,0.1250g/mL,respectively. No antibacterial effect was observed onRhizopusorPseudomonassp. The six compounds were named sample obtained by 10% methanol,sample obtained by 20% methanol ,sample obtained by 30% methanol,sample obtained by pure methanol,sample obtained by pure methanol with a few ammonia ,and sample obtained by water according to their polarities isolated by silica gel column chromatography. The activities of sample obtained by 10% methanol and sample obtained by 20% methanol were higher than that of ethyl acetate extract. While,the sample obtained by 30% methanol and sample obtained by pure methanol did not show antibacterial activities on most of strains. Strikingly,the sample obtained by water exhibited antibacterial activities onPseudomonassponly. Thus,the ethyl acetate extract and six compounds isolated by silica gel column chromatography had good antimicrobial activities. Silica gel column chromatography provided good separation of active extract. This research was profitable for the study and use of the maleEucommiaflowers.

maleEucommiaflowers;ethyl acetate extract;inhibitive cycle diameter;activities

2013-12-24

李欣(1979-)，女，博士，副教授，研究方向：天然產物開發。

國家自然科學基金(31000017、31260059和30900105)。

TS201.2

A

1002-0306(2015)11-0062-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.11.004