螺旋環螺旋結構域擴散激酶(CHUK)基因多態性影響缺血性中風痰瘀阻證血脂代謝*

韋湫桂，吳艷麗，陳子文，周金英，謝娟娟，古 聯△

(1.廣西中醫藥大學研究生學院，廣西 南寧 530001；2.廣西中醫藥大學第一附屬醫院，廣西 南寧 530023)

·實驗研究·

螺旋環螺旋結構域擴散激酶(CHUK)基因多態性影響缺血性中風痰瘀阻證血脂代謝*

韋湫桂1，吳艷麗1，陳子文1，周金英1，謝娟娟2，古 聯2△

(1.廣西中醫藥大學研究生學院，廣西 南寧 530001；2.廣西中醫藥大學第一附屬醫院，廣西 南寧 530023)

目的 分析CHUK 基因多態性與缺血性中風風痰瘀阻證及氣虛血瘀證血脂水平的關聯。方法 共納入341例風痰瘀阻證及284例氣虛血瘀證缺血性中風病例。采用Sequenom MassARRAY iPLEX進行CHUK 3個位點(rs3808917，rs2230804，rs3808916)基因分型，運用HITACHI日立7600 全自動生化分析儀測定血脂水平。結果 在風痰瘀阻證患者中，TG(TG：F=3.125，P=0.045)、LDL-C(LDL-C：F=3.58，P=0.029)水平在不同rs3808917基因型攜帶者之間的分布差異均具有統計學意義。在氣虛血瘀證患者中，TC、Tg，HDL-C、LDL-C水平在不同CHUK基因多態性基因型攜帶者之間、或在不同等位基因攜帶者之間的分布差異均無統計學意義(P>0.050)。結論 CHUK 基因遺傳多態性可能影響缺血性中風痰瘀阻證的血脂代謝，但不影響氣虛血瘀證的血脂水平。

中風證型；CHUK基因；遺傳多態性；血脂

中醫學認為缺血性腦卒中屬于“中風”，全球每年約550 萬人死于中風，且每年用于治療中風的費用高達38.6 億美元[1]。動脈粥樣硬化是中風發生的主要病機之一，而血脂紊亂與動脈粥樣硬化形成有密切關系。螺旋環螺旋結構域擴散激酶(CHUK)基因編碼的蛋白質是核因子NF-kappa-B復合物的抑制劑，其參與調控的NF-kappa-B通路可影響中風的病理過程[2]。既往有研究表明CHUK基因rs11597086位點與血脂升高有關[3]，提示CHUK基因多態性可能影響血脂代謝。中醫學認為中醫證型具有一定分子遺傳基礎[4]，基因序列的多態性決定了個體的差異，在臨床則表現為不同的證候群[5]，并可能影響不同證候群相關生化基礎物質。本研究旨在分析CHUK基因3個分別位于5’near端，外顯子，3’near端的多態性位點(rs3808917，rs2230804，rs3808916)與缺血性中風風痰瘀阻證、氣虛血瘀證血脂水平的相關性。

1 對象和方法

1.1 研究對象 納入625例于2009年7月—2014年6月在廣西中醫藥大學第一附屬醫院中醫腦病科住院的缺血性中風病例，包括341例風痰瘀阻證，平均年齡(64.46±10.42)歲、284例氣虛血瘀證，平均年齡(66.99±10.45)歲。西醫診斷標準：參照全國第四屆腦血管病學術會議修訂的《各類腦血管病診斷要點》中相關標準。所有患者均經過至少兩名主治以上職稱的神經內科醫師及影像學檢查(頭顱CT和、或MRI)確診。中醫診斷標準及證候辨證分型標準：參照國家中醫藥管理局全國腦病急癥科研協作組制訂的《中風病診斷療效評定標準(試行)》，每名缺血性中風患者均經2名經統一培訓的主治以上職稱的中醫醫師進行中醫證候分型。本研究納入符合中西醫診斷及證候辨證分型標準的2個證型(風痰瘀阻、氣虛血瘀證)的中風患者進行研究。排除標準：(1)有腫瘤、心臟源性栓塞、腦外傷、短暫性腦缺血發作(TIA)、腦血管畸形等其他原因引起的缺血性中風；(2)合并系統性疾病。所有研究對象均為自我報告為廣西漢族人，相互之間均無親緣關系，且均知情同意。

2 標本DNA提取 于研究對象入院后次日清晨空腹時抽取2ml靜脈血于抗凝管內，混勻，4℃冰箱保存，并在7d內完成DNA提取。采用北京天根科技有限公司生產的TIANamp Blood DNA Kit(離心柱形)血液基因組DNA提取試劑盒嚴格按照產品說明書操作步驟進行血液基因組DNA提取，提取完成后分裝為3管，放置于-80℃保存備用。

3 基因分型 采用Sequenom MassARRAY iPLEX實驗平臺對CHUK基因3個位點進行基因分型。采用Sequenom Assay Designer 3.1software(Sequenom，San Diego，CA，USA)進行引物設計，引物序列如表1所述。PCR反應體系(總體積為5μl)構建如下：10 ng/μl DNA 模板1 μL，10 x PCR Buffer0.5 μL，25 mM MgCl20.4 μL，25 mM dNTP Mix0.1 μL，0.5 uM Primer Mix1μL，5 U/μL HotStar Taq0.2 μL，和H2O 1.8 μL。

表1 候選SNPs 的引物序列信息

1.4 血脂水平測定 抽取研究對象外周靜脈血2 mL，置于非抗凝管內，并直接送往醫院檢驗科采用HITACHI日立7600 全自動生化分析儀按照標準化試驗程序檢測總膽固醇(TC)、甘油三脂(TG)、高密度脂蛋白(HDL-C)、低密度脂蛋白(LDL-C)水平。

2 結果

2.1 不同rs3808917基因型、或等位基因攜帶者之間的血脂水平比較 在風痰瘀阻證患者中，Tg，LDL-C水平在不同rs3808917基因型攜帶者之間的分布差異具有統計學意義(TG：F=3.125，P=0.045；LDL-C：F=3.58，P=0.029)。在氣虛血瘀證患者中，TC、Tg，HDL-C、LDL-C水平在rs3808917位點不同基因型攜帶者之間的分布差異均無統計學意義(P>0.050)，且A等位基因和C等位基因攜帶者之間的TC、Tg，HDL-C、LDL-C水平差異亦無統計學意義(P>0.050)。見表2、表3。

表2 風痰瘀阻證患者中不同rs3808917 基因型、或等位基因攜帶者的血脂水平比較

表3 氣虛血瘀證患者中不同rs3808917 基因型、或等位基因攜帶者的血脂水平比較

2.2 不同rs2230804基因型、或等位基因攜帶者之間的血脂水平比較 在風痰瘀阻證患者中，TC、Tg，HDL-C、LDL-C水平在不同rs2230804基因型攜帶者之間的分布差異均無統計學意義(P>0.050)，它們在不同等位基因攜帶者之間的分布差異亦無統計學意義(P>0.050)。在氣虛血瘀證患者中，TC、Tg，HDL-C、LDL-C水平在不同rs2230804基因型攜帶者之間的分布差異均無統計學意義(P>0.050)，它們在不同等位基因攜帶者之間的分布差異亦無統計學意義(P>0.050)。見表4、表5。

表4 風痰瘀阻證患者中不同rs2230804 基因型、或等位基因攜帶者的血脂水平比較

表5 氣虛血瘀證患者中不同rs2230804 基因型、或等位基因攜帶者的血脂水平比較

2.3 不同rs3808916基因型、或等位基因攜帶者之間的血脂水平比較 在風痰瘀阻證患者中，TC、Tg，HDL-C、LDL-C水平水平在不同rs3808916基因型攜帶者之間的分布差異均無統計學意義(P>0.050)，它們在不同rs3808916等位基因攜帶者之間的分布差異亦無統計學意義(P>0.050)。在氣虛血瘀證患者中，TC、Tg，HDL-C、LDL-C水平在不同rs3808916基因型攜帶者之間的分布差異均無統計學意義(P>0.050)，且T等位基因和C等位基因攜帶者之間的TC、Tg，HDL-C、LDL-C水平差異亦無統計學意義(P>0.050)。見表6、表7。

表6 風痰瘀阻證患者中不同rs3808916基因型、或等位基因攜帶者的血脂水平比較

表7 氣虛血瘀證患者中不同rs3808916基因型、或等位基因攜帶者的血脂水平比較

3 討論

中醫學認為中風病主要病機為本虛標實，其病理因素主要有虛、火、風、痰、氣、血、毒六邪。朱丹溪首提“半身不遂，大率多痰。多是濕土生痰，痰生熱，熱生風也”；《明醫雜著》曰：中風乃血氣津液所行之處，皆凝滯郁遏，不得流通所致。“痰”停聚于體內，造成一系列錯綜復雜的病理過程；膏脂與津液同源，是津液的稠濁狀態即為膏脂，其能入血。目前“痰瘀故邪、痰致中風”已深入人心。現代醫學認為血管壁病變、血液成分和血液動力學改變是引起中風的主要原因。動脈粥樣硬化是其基本病因之一，而高脂血癥被認為是通過引起動脈粥樣硬化而引起腦血管病。《赤水玄珠全集》曰：若血濁氣滯，則凝聚為痰，滯于營中，浸淫血脈，即成血脈痰濁。而血濁、痰凝與現代醫學高血脂癥的概念相似，是中風發病的重要病理基礎之一。

CHUK基因編碼核因子NF-kappa-B復合物的一種抑制劑，其編碼的蛋白可使NF-kappa-B信號通路上的節點磷酸化，從而激活核錄因子NF-kappa-B，促進成套促炎基因的表達，最終促進了動脈粥樣硬化形成[6]。在Asselbergs的meta研究中發現CHUK基因上rs11597086位點與血脂紊亂有關[3]。而筆者的研究發現在風痰瘀阻證患者中，Tg，LDL-C水平在CHUK多態性rs3808917不同基因型攜帶者之間的分布差異具有統計學意義，提示CHUK基因rs3808917多態性影響中風風痰瘀阻證的血脂代謝。rs3808917 位于臨近5’UTR端，而5’非編碼區(5’UTR)已被證明在翻譯表達過程中通過與某些調控因子的結合對基因差異表達進行調控[7]。中醫醫家認為痰飲內停阻滯氣機易形成瘀血，而瘀血內阻亦影響津液代謝，進一步形成痰飲。朱丹溪則提出“治風當以治痰”。名醫關幼波提出痰與血同屬陰，易于交結凝固，治痰要治血，血行則痰化，可見痰瘀是缺血性中風最主要的病機。現代醫學已經證明脂質代謝紊亂是引起頸動脈的粥樣硬化的物質基礎，而頸動脈粥樣硬化與中風的發生密切相關[8-10]。趙玲等[11]認為高脂血癥為血中有痰濁之氣，痰濁瘀血凝聚滯于血中致血液呈“黏”、“濃”、“凝”、“聚”狀態，表明脂質代謝異常的病理改變屬于“痰瘀”范疇。黃先長等[12]在血脂與中風中醫證型研究中，發現血清TC、TG及LDL-C水平等血脂指標可作為中風證型的生化物質基礎。與我們研究結果相類似的是，既往已有中醫學研究報道易感基因遺傳多態性影響中醫證型的血脂代謝。如歐陽濤[13]發現在冠心病痰瘀證中，TG和LDL-C 水平在-/-、-/+、+/+基因型患者中存在漸升的趨勢，+/+基因型的TC 水平和動脈硬化指數顯著高于-/-基因型，表明LDL-R基因可能影響冠心病痰瘀證的血脂代謝，從而促進動脈硬化形成。另外梁晉普等[14]人報道ApoE基因多態性可能影響高脂血癥痰瘀證的血脂代謝，且占呈燕等[15]更進一步的研究發現在痰瘀證高脂患者中，TG水平在ApoE基因攜帶E2/3基因型與攜帶E3/3和E3/4基因型的分布差異顯著。而現代醫學研究也發現一些遺傳多態性位點基因型的差異會導致缺血性中風的血脂代謝差異。例如，Peng[16]等人研究發現TG水平在TGF-β1基因C-509T位點攜帶TT基因型、TC基因型及CC基因型分布具有顯著性差異，還發現LDL-C水平在該基因869T/C位點上攜帶TT基因型、TC基因型及CC基因型分布同樣具有顯著性差異；另有陳玉蘭[17]等報道Ser447Ter基因G等位基因的血脂(TC、TG及HDL-C)水平較C等位基因攜帶者高，提示Ser447Ter基因影響缺血性中風的血脂水平。

因此，根據本研究結果，CHUK基因多態性可能影響缺血性中風風痰瘀阻證的血脂代謝。

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Influence of Helix-loop-helix Domain Diffusion Kinase (CHUK) Gene Polymorphism on Lipid Metabolism of Ischemic Stroke and Phlegm Stasis Resistance Syndrome

WEI Qiu-gui1, WU Yan-li1, CHEN Zi-wen1, ZHOU Jin-ying1, XIE Juan-juan2, GU Lian3

(1.SchoolofPostgraduates,GuangxiUniversityofTraditionalChineseMedicine,Nanning530001,Guangxi;2.ICUDepartment,TheFirstAffiliatedHospitalofGuangxiUniversityofTraditionalChineseMedicine,Nanning530023,Guangxi;3.NeurologyDepartment,TheFirstAffiliatedHospitalofGuangxiUniversityofTraditionalChineseMedicine,Nanning530023,Guangxi)

Objective: To analyze the correlation of CHUK gene polymorphism and ischemic stroke and phlegm stasis syndrome (PS) as well as lipid level of qi deficiency blood stagnation syndrome(QDBS). Methods: 341 PS patients and 284 ischemic stroke QDBS patients were taken into analysis. Sequenom Mass ARRAY iPLEX was used to conduct 3 loci of CHUK (rs3808917, rs2230804, rs3808916) genotyping. HITACHI 7600 automatic biochemical analyzer was used to detect blood lipid level. Results: Among the PSR patients, the distribution differences of TG (TG: F=3.125, P=0.045), LDL-C (LDL-C: F=3.58, P=0.029) between the different levels of rs3808917 genotype were statistically significant. Among the QDBS patients, the distribution differences of TC, Tg, HDL-C, LDL-C levels between different CHUK polymorphism genotype carriers, or between different allele carrier showed no statistical significance (P>0.050). Conclusion: The CHUK genetic polymorphism may affect the lipid metabolism of ischemic stroke PS patients, but does not affect the lipid level of the QDBS patients.

stroke syndrome, CHUK gene, genetic polymorphism, lipid

國家自然科學基金課題(NO.81260594)，廣西自然科學基金課題(NO.2013 gXNSFAA019145)，廣西中醫藥大學校級課題(NO.GZYQJ2014018)

韋湫桂(1986-)，女，廣西人，研究方向：中西醫結合防治腦血管疾病。

△通信作者：古聯，E-mail：gulian2012@163.com

R255.2

A

1007-2349(2015)12-0061-04

2015-10-26)