血清淀粉酶測定結果的溯源與方法學分組的關系

王衛兵

（首都醫科大學 產業經營與管理中心，北京 100069）

在一項血清酶測定結果可溯源性研究中［1］，研究者在市三級醫院的50家檢驗科或其他臨床實驗室統一發放由日本臨床化學協會（JSCC）推薦的酶參考物（ERM）1支（日本旭化成株式會社生產），各實驗室按現行操作規程要求進行定標（用K值計算時省略此步）和室內質控測定，再測定ERM，重復測定10次，在指定日期內完成檢測，取均值上報檢驗中心統計計算，統計中一次性排除大于均值±2SD的數據。作者對50家ERM的測定結果均值與ERM標示值比較。按研究中采用的實驗方法和統計方法，每個實驗項目用來與標示值比較的均值乃是10次測定結果的均值/每個實驗室×50個實驗室共500個數據的均值，并且一次性剔出50個均值中大于均值±2SD數據；在測定ERM的同時做了室內質控，應當是在控狀態。有鑒于此，對ERM的測定結果均值與標示值間的相對偏倚屬系統誤差。相對偏倚大的項目之一是淀粉酶（AMY）為負的16.8%，同時室間變異達29%。作者對此討論指出“AMY實驗室測定結果CV高達29%，提示可能存在方法學上的問題”，而對16.8%的系統誤差出現原因未進行討論。我們查對了50家實驗室所用11個不同來源AMY試劑盒主要的測定原理和試劑組成，現就AMY測定結果溯源性［2］如何科學合理進行方法分組進行討論。

1 AMY常規測定方法和試劑盒應用現狀

目前在臨床實驗室常規化驗中使用的AMY試劑盒主要有7個不同來源［3］（見表1）。其中有5個是使用相同底物4，6－亞乙基－（G7）－1，4－對－硝基酚－（G1）－α－麥芽七糖苷（EG7P），其結構式見圖1。

圖1 EG7P結構式

表1 7種常用AMY試劑盒測定原理、成分比較

但這五家之間所用緩沖液種類有差別其中二家與IFCC推薦法［4］所用緩沖系統相同是HEPES，而另二個分別用Pipes和Goods緩沖液。另一來源的AMY試 劑 盒 用 的 底 物 是 2－氯－4－硝 基 酚－α－麥 芽 三 糖 苷CNPG3），只有一家AMY試劑盒使用的底物是苯甲基－對－硝基酚－麥芽五糖苷（BG5P）。AMY測定方法分組主要依據即是AMY作用底物結構，不同方法組間存在有統計學意義的明顯系統誤差。這正是為什么采用這7種不同來源AMY試劑盒檢測ERM的AMY活性會出現如此大的負偏倚的主要原因。

2 BG5P法與EG7P法之間的系統誤差

日本旭化成株式會社生產的酶校正血清AMY測定采用的底物是對硝基酚－苯甲基－α－麥芽5糖苷（BG5P），JSCC釆用以BG5P（其結構式見圖2）和EG7P為底物的2個方法測定一批血清AMY活性，相關散點圖見圖3。

圖2 BG5P結構式

圖3 血清AMY活性測定BG5P法與EG7P法相關散點圖

從圖3可見，用BG5P測出的AMY活性比在EG7P中測出的活性高出約1.67倍。那么，上述研究中50家醫院臨床實驗室測定旭化成ERM中AMY活性均值為274U/L，ERM標示值329U/L，比其高1.20倍，兩者相差55U/L，這應是50家參評實驗室釆用不同底物試劑盒與ERM的BG5P之間系統誤差的均值［5］。這是不同方法間客觀存在偏差正常表現，而不能依此作出參評實驗室AMY測定不準確的結論。

3 EG7P法與PNPG7法之間的系統誤差

麥芽七糖非還原端不封閉底物1，4—對—硝基酚—（G1）—α—麥芽七糖苷（PNPG7）與EG7P比較，就是因為麥芽七糖苷非還原端被亞乙基封閉，改變了底物結構進而導致AMY與底物之間“誘導契合”相互作用的繼發改變。二者的酶促反應時間曲線見圖4。

圖4 AMY.活性測定2種方法酶促反應時間曲線的比較

可見，EG7P法比PNPG7法37℃反應延遲時間縮短約2min，線性反應圍擴展，在整個測量范圍內維持零級反應動力學；但二者測定結果在3個儀器系統做血清AMY活性平行測定，PNPG7法比EG7P法高［6］，部分實驗數據見表2。

表2 AMY活性測定EG7P（Y）與PNPG7（X）2種方法比較

實驗證明，二者相關及回歸與溫度無關，EG7P測定結果乘以系數2.5即可轉換為心PNPG7結果，截矩a可略而不計。可見，不能籠統地將AMY測定方法分為“麥芽七糖組”。“麥芽七糖組”至少應分開3組，即EG7P、BG7P和PNPG7，AMY校正物的選擇應用和結果溯源也應按此原則分組進行。

4 EG7P法與其他幾種底物方法的相關與回歸分析

回歸分析［7］結果見表中。從表3數據可見，因底物結構的差異而導致各方法組間AMY結果分布在－1.11～3.89U/L之間；b值分布在0.444～1.728之間。此結果的偏倚、回歸分析表明4種不同底物方法與EG7P方法組比較，a值分組結果同樣說明AMY的必須科學嚴謹進行方法分組，做到“對號入座”、“各就各位”。

表3 EG7P法與其他幾種底物方法的相關與回歸分結果

5 討論

影響AMY測定結果，除底物不同外，還會有其他因素如底物濃度、緩沖液、pH值、離子強度、輔助酶、輔因子的種類和濃度等，試劑盒的性能質量、校正方法、儀器性能、儀器分析中的參數設置、儀器維護保養、操作規程等凡構成“AMY檢測系統”的各要素中任一環節出現問題都會影響到最后的結果。我們需從“檢測系統”宏觀上去看待每個具體的一個個要素；而在分析一個個具體要素對結果的影響時，又要依據“檢測系統”的概念綜合考慮。在AMY“檢測系統”間，影響檢測結果的主要因素是底物的種類和試劑的配方。在一系列關于不同檢測系統血清酶測定結果的偏倚評估與可比性研究中都發現檢測系統間AMY測定值的系統誤差不能被接受，其原因也應按上述思路進行分析［8］。

為了做好血清酶測定結果的溯源，應學習IFCC發布的文件〔PⅡS0009—9120（98）00039—3〕［9］，該文件以實例證明酶校正物的可交換性，只能在有相同分析特異性的方法組內進行，一再強調的是“同方法組”概念。不問酶校正物定值的檢測系統與常規實驗室檢測系統間是否存在可比性，一律要求在常規實驗室中將不屬同一檢測系統的結果硬拉到校正物定值上，這不僅無助于提高酶測定實驗質量，相反會造成測定結果和臨床應用的混亂［10］。正如關于“酶校正物在血清酶測定中的應用”［11］一文表明的那樣：一個廠家的校正品一般是在自己的測定系統內進行評估的，在同類系統內它能很好地把測定結果的值在參考方法和常規方法間傳遞，但不一定適合另一個廠家的測定系統，因此不要把一個廠家在特定檢測系統生產的校正品用來校正另一個檢測系統［12］。徐國賓等在分析研究酶校正物定值流程和定值傳遞流程后強調：“目前臨床化學在進行血清酶活性濃度測量校準時張家校準品張冠李戴的情況應該糾正”［13］。可見，在酶活性測定結果可溯源性研究中，不問AMY常規方法所用底物種類，根據常規實驗室用常規方法測出ERM結果偏離ERM標示值即認定常規方法不準確是不符合酶活性測定結果可溯源基礎理論和準則的。

（

）

［1］王清濤，童清，郭健.血清酶測定結果可溯源性研究［J］.中華檢驗醫學雜志，2003，26（12）：761－763.

［2］北京市醫療器械檢驗所.GB/T 21415—2008體外診斷醫療器械生物樣品中量的測量 校準品和控制物質賦值的計量學溯源性［S］.北京：中國標準出版社，2008.

［3］韓志軍，黃志鋒，盧業成，等.臨床化學常用項目自動化分析法［M］.3版.沈陽：遼寧科學技術出版社，2005：826－835.

［4］Gerhard Schumann，Ryozi Aoki，Carlo A Ferrero.IFCC primary reference procedures for the measurement ofcatalytic activity concentrations of enzymes at 37℃［J］.Clin Chem Lab Med ，2006：44（9）.

［5］Katsuhiko Kuwa.Scientiifc Division of Japan Society of Clinical Chemistry：Proposed standard for certified enzyme reference materials（ERM）［J］.Japan J Chem，2000，29：77－92.

［6］Kruse/Jarres J D.C.Kaiser Evalution of a new a－Amylase Assay Using 4，5－Ethylidene－（GT）－1－4－nitrophenyl－（G1）－a－D－maltoheptaoside［J］.Clin.Biochem，1989，27：103－113.

［7］張連祥，劉晨梅，蔡忠，等.七種試劑盒檢測a－淀粉酶結果的比較及分析［J］.天津醫藥，2002，30（9）：554－555.

［8］張秀明，莊俊華.不同檢測系統血清酶測定結果的偏倚評估與可行性研究［J］.中華檢驗醫學雜志，2006，29（4）：369－349.

［9］Georges F，John E，Takashi K.Validation of an Enzyme Calibrator－An IFCC Guideline〔PⅡS0009－9120（98）00039—3〕［J］.Clin Biochem，1998，31（6）：495－500.

［10］文慶成.臨床酶測定標準化的幾個問題［J］.中華檢驗醫學雜志，1998，21（1）：60－61.

［11］蘇增留，張克堅，郭健，等.酶校品在血清酶測定結果標準化中的應用［J］.上海醫學檢驗，2001，16（2）：79－83.

［12］湯蓓，石凌波，李爾凡.酶校正品在血清酶測定中的應用［J］.檢驗醫學，2005（20）：143－145.

［13］徐國賓，吳南，王清濤.要重視血清酶學測定的標準化工作［J］.臨床檢驗雜志，2007，25（3）：161－164.