截留相對(duì)分子質(zhì)量1000的超濾膜優(yōu)選半夏白術(shù)天麻湯方藥半仿生法提取藥材組合方式

徐 男 ，時(shí)海燕 ，蔡梅超

(1.山東省中醫(yī)藥研究院，山東 濟(jì)南 250014； 2.山東省千佛山醫(yī)院，山東 濟(jì)南 250014；3.山東中醫(yī)藥大學(xué)，山東 濟(jì)南 250355)

在優(yōu)選出半仿生(SBE)法提取工藝條件的基礎(chǔ)上，以天麻素、甘草次酸、高效液相色譜（HPLC）總面積、總黃酮、分子量≤1000提取物為指標(biāo)綜合評(píng)判，優(yōu)選半夏白術(shù)天麻湯方藥較佳提取組合方式。現(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與材料

KQ－250E型醫(yī)用超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；FA1100型電子分析天平(上海精密科學(xué)儀器有限公司)；Mettler AE 240型電子分析天平(瑞士梅特勒公司)；PHS2－3C型精密pH計(jì)(上海雷磁儀器廠)；LXJ－Ⅱ型離心沉淀機(jī)(上海醫(yī)療器械三廠)；箱式電阻爐(上海申光儀器儀表有限公司)；日立Μ－3010型紫外可見分光光度計(jì)；高效液相色譜儀、工作站及紫外檢測器(美國Agilent公司)；血清超濾器(上海德宏生物醫(yī)學(xué)科技發(fā)展有限公司)。

本試驗(yàn)所用中藥經(jīng)張兆旺教授鑒定，半夏為天南星科植物半夏 Pinellia ternate(Thunb.)Breit.的干燥塊莖；天麻為蘭科植物天麻 Gastrodia elata Bl.的干燥塊莖；茯苓為多孔菌科真菌茯苓Poria cocos(schw.)Wolf.的干燥菌核；橘紅為蕓香科植物橘Citrus reticulata Blanco及其栽培變種的干燥外層果皮；白術(shù)為菊科植物白術(shù) Atractylodes macrocephala Koidz.的干燥根莖；甘草為豆科植物甘草 Glycyrrhiza uralensis Fisch.的根及根莖。

天麻素對(duì)照品(批號(hào)110807－200205)，柚皮苷對(duì)照品(批號(hào)110722－200309)，甘草次酸對(duì)照品(批號(hào) 723－9002)，均供含量測定用，購自中國藥品生物制品檢定所。高效液相用甲醇、乙腈為色譜純，水為自制高純水，其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 藥材組合方式

半夏白術(shù)天麻湯由6味中藥組成，按君、臣、佐、使組方原則分為 4組：A 組(半夏、天麻)、B 組(白術(shù))、C 組(茯苓、橘紅)、D 組(甘草)。排列組合為 15組，分別為1號(hào)(ABCD)，2號(hào)(A＋B＋C＋D)，3號(hào)(AB＋C＋D)，4號(hào)(AC＋B＋D)，5號(hào)(AD＋B＋C)，6號(hào)(BC＋A＋D)，7號(hào)(BD＋A＋C)，8號(hào)(CD＋A＋B)，9號(hào)(AB＋CD)，10號(hào)(AC＋BD)，11號(hào)(AD ＋BC)，12 號(hào)(ABC＋D)，13號(hào)(ABD＋C)，14號(hào)(ACD＋B)，15號(hào)(BCD＋A)。其中 AB＋C＋D，即用優(yōu)選出的SBE法條件提取，AB為2味中藥合并提取，提取液依次粗濾，離心(3 500 r/min，25 min)，一定規(guī)格的中空纖維膜濾過；C和D分別單獨(dú)提取，提取液依次粗濾，離心(3 500 r/min，25 min)，一定規(guī)格的中空纖維膜濾過，濃縮，合并3種濃縮液，定容至1000 mL。其余類推。

2.2 溶液制備

按處方比例稱取 10～20目的 A，B，C，D 粗粉，按 2.1項(xiàng)下組合方式，用優(yōu)選的SBE法工藝，分別提取3次[(加水量為中藥重量的 10，8，8 倍，水的 pH 為 2.0，6.5，8.5，提取時(shí)間依次為120 min，90 min，90 min，提取液依次粗濾，離心(3 500 r/min，25 min)]，一定規(guī)格的中空纖維膜濾過，濃縮，定容至1000 mL，即得樣品溶液。精密吸取樣品溶液SBEE1～18各10 mL，蒸干，殘?jiān)靡译妫?3∶97)混合溶液溶解定容至10 mL，經(jīng) 0.45 μm微孔濾膜濾過，即得供試品溶液 B1～18(質(zhì)量濃度為 0.092 g /mL)，供天麻素含量和HPLC總面積的測定。精密吸取樣品溶液SBEE1～18各25 mL，加氯仿 30 mL、鹽酸 2.5 mL，水浴回流 1.5 h，用 20 mL 氯仿萃取2次，回收氯仿，甲醇定容至10 mL，經(jīng) 0.45 μm微孔濾膜濾過，即得供試品溶液 C1～18(質(zhì)量濃度為 0.23 g /mL)，供甘草次酸的測定。精密吸取樣品溶液SBEE1～18各100 mL，濃縮并定容至50 mL，即得供試品溶液 D1～18(質(zhì)量濃度為 18.4 g /mL)，供測定相對(duì)分子質(zhì)量≤1000提取物得率和總黃酮含量。

2.3 天麻素含量測定[1－2]

色譜條件：色譜柱為DiamonsilTM(鉆石)C18柱(200 mm×4.6 mm，5 μm)；流動(dòng)相為乙腈－0.05% 磷酸(3 ∶97)；檢測波長 220 nm，參比波長 360 nm；柱溫 25℃；流速 1.0 mL /min；進(jìn)樣量 20μL。

對(duì)照品溶液制備：精密稱取經(jīng)80℃干燥恒重1 h的天麻素對(duì)照品4.35 mg，置 25 mL容量瓶中，加乙腈－水(3∶97)溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得天麻素對(duì)照品溶液A(0.174 g/L)，置4℃冰箱中保存。

線性關(guān)系考察：按擬訂色譜條件，取天麻素對(duì)照品溶液(0.087 g /L)，分別自動(dòng)進(jìn)樣 5，10，20，40，80 μL，測定峰面積。以對(duì)照品溶液的進(jìn)樣量(μg)為橫坐標(biāo)、峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，回歸方程為 Y＝1 681.2 X＋84.154，r＝0.999 9。結(jié)果表明，天麻素進(jìn)樣量在0.435～6.96 μg范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

含量測定：取 2.2 項(xiàng)下供試品溶液 B1～18，分別進(jìn)樣 20 μL，記錄天麻素色譜峰面積，外標(biāo)一點(diǎn)法計(jì)算含量。結(jié)果見表1和圖1。

2.4 甘草次酸含量測定[3]

色譜條件：色譜柱為 DiamonsilTM(鉆石)C18柱(200 mm×4.6 mm，5 μm)；流動(dòng)相為甲醇－0.1% 磷酸(87 ∶13)；檢測波長250 nm，參比波長 360 nm；柱溫 25 ℃ ；流速 1.0 mL /min；進(jìn)樣量20 μL。

對(duì)照品溶液制備：精密稱取甘草次酸對(duì)照品2.90 mg，置100 mL容量瓶中，加甲醇使溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得甘草次酸對(duì)照品溶液 B(0.029 g /L)。

線性關(guān)系考察：按擬訂色譜條件，取甘草次酸對(duì)照品溶液(0.029 g /L)，分別自動(dòng)進(jìn)樣 5，10，20，40，60，100 μL，測定峰面積。以對(duì)照品溶液的進(jìn)樣量(μg)為橫坐標(biāo)、峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，回歸方程為 Y＝2 478.2 X－39.38，r＝0.999 8，直線過原點(diǎn)。結(jié)果表明，甘草次酸進(jìn)樣量在 0.145～1.740 μg范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

表1 天麻素含量測定結(jié)果

圖1 天麻素含量測定高效液相色譜圖

含量測定：取 2.2 項(xiàng)下供試品溶液 C1～18，分別進(jìn)樣 20 μL，記錄甘草次酸色譜峰面積，外標(biāo)一點(diǎn)法計(jì)算含量。結(jié)果見表2和圖2。

2.5 總黃酮含量測定[4－5]

對(duì)照品溶液制備：精密稱取105℃干燥至恒重的柚皮苷對(duì)照品9.25 mg，置50 mL棕色容量瓶中，加蒸餾水溶解稀釋至刻度，搖勻，得柚皮苷對(duì)照品溶液 C(0.185 0 mg/mL)。

標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制：精密吸取柚皮苷對(duì)照品溶液 0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 mL，分別置干燥具塞試管中，加入甲醇 1 mL，再加入10%KOH溶液 0.5 mL，室溫放置 5 min，用甲醇稀釋并定容至10mL，以甲醇作空白對(duì)照，在412 nm波長處測定吸光度。以質(zhì)量濃度 C(μg/mL)為橫坐標(biāo)、吸光度(A)為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，回歸方程為 A＝0.053 2 C ＋0.009 2，r＝0.999 8。結(jié)果表明，總黃酮質(zhì)量濃度線性范圍為 3.70 ～ 18.50 μg/mL。

含量測定：取 2.2項(xiàng)下供試品溶液 D1～18，依法測定含量。結(jié)果見表3。

2.6 HPLC積分總面積測定

色譜條件：色譜柱為 DiamonsilTM(鉆石)C18柱(200 mm×4.6 mm，5 μm)；流動(dòng)相為乙腈(A)－水(B)，線性梯度洗脫，時(shí)間程序?yàn)?0 min→45 min(A 5%→45%)，45 min→60 min(A 45%→100%)；流速 1.0 mL /min；檢測波長 324 nm，參比波長 400 nm；柱溫 25 ℃ ；進(jìn)樣量 20 μL。

HPLC積分總面積測定：精密吸取2.2項(xiàng)下供試品溶液B1～18，按擬訂的液相色譜條件，依法測定。結(jié)果見表4和圖3。

表2 甘草次酸的含量測定結(jié)果

圖2 甘草次酸對(duì)照品色譜圖

表3 總黃酮含量測定結(jié)果

表4 HPLC積分總面積的測定結(jié)果

圖3 半夏白術(shù)天麻湯高效液相色譜圖

2.7 相對(duì)分子質(zhì)量1000提取物得率測定

取2.2項(xiàng)下供試品溶液D1～18各25 mL，平行取3份，置蒸發(fā)皿中，水浴蒸至近干，于105℃烘至恒重，計(jì)算相對(duì)分子質(zhì)量≤1000提取物的得率。結(jié)果見表5。

表5 相對(duì)分子質(zhì)量≤1000提取物測定結(jié)果

2.8 綜合評(píng)判優(yōu)選方藥組合方式

將表1至表5中天麻素、甘草次酸、總黃酮、HPLC積分總面積、相對(duì)分子質(zhì)量≤1000提取物得率測定的數(shù)據(jù)，按公式 X′i.j＝進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理 (Xi.j為樣品液 i中成分 j的含量，Xj為 18個(gè)水平樣品液 i中成分 j的平均值，Sj為成分 j的標(biāo)準(zhǔn)偏差，即為標(biāo)準(zhǔn)化后的值)。將標(biāo)準(zhǔn)化后的 X′i.j值，根據(jù)各指標(biāo)在工藝選擇中的主次給予不同的加權(quán)系數(shù)，以標(biāo)準(zhǔn)化后的值 X′i.j加權(quán)后求和，即得綜合評(píng)價(jià)指標(biāo) Y值。Y＝(天麻素 ＋甘草次酸)/(2×5)＋(總黃酮 ＋HPLC總峰面積)/(2×3)＋相對(duì)分子質(zhì)量≤1000 Da提取物 ×2，依法標(biāo)準(zhǔn)化加權(quán)求和處理。結(jié)果見表6和圖4。由表6可知，第1號(hào)供試品溶液綜合評(píng)判指標(biāo)的 Y值最大，即本方藥材以ABCD組合為較佳。

表6 各指標(biāo)成分含量及標(biāo)準(zhǔn)化處理結(jié)果

圖4 15種組合各指標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)化 Y值柱形圖

3 討論

中藥復(fù)方提取是一個(gè)復(fù)雜的理化反應(yīng)過程，方藥各成分間存在相互作用，在煎提過程中可產(chǎn)生增溶、沉淀、催化分解、化合反應(yīng)等理化現(xiàn)象，影響成分的提取率及藥效的發(fā)揮。文獻(xiàn)顯示和實(shí)際工作經(jīng)驗(yàn)均證明，中藥中結(jié)構(gòu)比較明確且具有藥理作用的活性成分相對(duì)分子質(zhì)量一般小于或等于1000。結(jié)合現(xiàn)代膜分離技術(shù)[6－10]，以此類提取物作為最終產(chǎn)物，不僅提取物得率大大降低，可縮小服用量，而且為選用現(xiàn)代藥物新劑型提供了可能，同時(shí)也提高了技術(shù)含量。以相對(duì)分子質(zhì)量≤1000的提取物為指標(biāo)，能體現(xiàn)中藥整體、綜合、客觀、模糊的特點(diǎn)，這是中藥藥效物質(zhì)提取研究設(shè)計(jì)中一種新思路，對(duì)中藥現(xiàn)代化研究很有借鑒意義。

為了研究方藥組合方式對(duì)成分提取的影響，本試驗(yàn)對(duì)半夏白術(shù)天麻湯方藥中的6味中藥按君臣佐使分為4組，即A(半夏、天麻)、B(白術(shù))、C(茯苓、橘紅)、D(甘草)，再排列組合成 15 種組合方式，用優(yōu)選的SBE法提取，提取液作天麻素、甘草次酸、總黃酮、HPLC積分總面積、相對(duì)分子質(zhì)量≤1000提取物的測定，并對(duì)這5個(gè)指標(biāo)數(shù)據(jù)作標(biāo)準(zhǔn)化處理，以消除各指標(biāo)單位和量綱不同以及各指標(biāo)變量范圍相差懸殊所造成的影響;同時(shí)根據(jù)各指標(biāo)在工藝選擇中的主次，給予不同的加權(quán)系數(shù)，加權(quán)后求和得綜合評(píng)判的 Y值，結(jié)果以ABCD的 Y值最大，說明該方提取時(shí)以半夏、天麻、茯苓、橘紅、白術(shù)和甘草全方藥混合提取為佳。

HPLC法流動(dòng)相梯度洗脫中，在檢測波長為324 nm、流動(dòng)相一致的色譜條件下，15種藥材組合方式提取液的色譜峰數(shù)及峰位基本一致，但積分值不同，表明15種藥材組合方式提取出的成分基本一致，但含量不同。本研究中采用多種指標(biāo)綜合優(yōu)選該方最佳藥材組合方式，符合中醫(yī)用藥發(fā)揮多種成分、綜合作用的特點(diǎn)，同時(shí)也利于用單體成分控制制劑的質(zhì)量。

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