注射用醋酸西曲瑞克的非臨床安全性評價

張 競，徐曉月，何 燕

（河南省食品藥品檢驗所，河南 鄭州 450003）

西曲瑞克為新合成的促性腺激素釋放激素拮抗劑，多用于接受控制性超排卵輔助生殖治療的婦女，防止過早出現的促黃體生成激素（LH）峰及控制隨后的排卵，以及治療子宮內膜異位癥[1]。筆者根據藥物分類和藥品注冊管理辦法及注射劑研制要求，按照國家食品藥品監督管理總局2005年《化學藥物刺激性、過敏性和溶血性研究技術指導原則》對注射用醋酸西曲瑞克的安全性進行評價，現報道如下。

1 材料

1.1 儀器與試藥

CP225D型電子天平（德國Sartorius公司）；UW8200S型電子天平（日本Shimadzu公司）；SF2000型三按鍵電子數顯卡尺（桂林廣陸數字測控股份有限公司）；RTZ－10A－RT型嬰兒秤（無錫市衡器廠）；GD100型恒溫循環水浴鍋（英國 Grant公司）；CH30型顯微鏡（日本Olympus公司）。注射用醋酸西曲瑞克（受試藥物，開封明仁藥業有限公司，規格為每瓶 0.25 mg，批號為 20120501）；注射用醋酸西曲瑞克（參比藥物，德國Baxter Oncology GmbH公司，規格為每瓶 0.25 mg，批號為 1D326A）；氯化鈉注射液（上海百正許昌藥業有限公司，規格為每支 100 mL∶0.9 g，批號為1112001）；牛血清白蛋白（瑞士Roche公司，規格為每瓶5 g，批號為A8020）；伊文思藍（上?；瘜W試劑采購供應站分裝廠進口分裝，批號為 08－11－02）。

1.2 動物

豚鼠，體重 250～350 g，雌性（無孕），質量合格證號為41001900000173；日本大耳白家兔，體重 2.0 ～3.0 kg，雌性（無孕），質量合格證號為41001900000213；均購自河南省康達實驗動物有限公司（動物試驗許可證號 SCXK＜豫＞2011－0001）。動物營養飼料購自河南省實驗動物中心（許可證號為 SCXK＜豫＞2010－0002）。動物單籠飼養，環境通風良好，12 h光照明暗交替，溫度（23±2）℃，濕度50% ～65%。

1.3 劑量換算[2]

注射用醋酸西曲瑞克用于下腹壁皮下注射，每日1次，每次0.25 mg，用注射用水溶解。以 60 kg體重計，臨床最大成人用劑量為 0.004 2 mg/kg，最大給藥濃度為 0.25 g /L；豚鼠以 300 g體重計、家兔以 2.5 kg體重計，豚鼠和家兔等效劑量分別為0.022 1 mg/kg 和 0.010 2 mg /kg。

2 方法與結果

2.1 全身主動過敏性試驗[2－5]

方法：取健康豚鼠24只，隨機分為4組，每組6只，分別為0.9%氯化鈉注射液陰性組；0.5%牛血清白蛋白陽性組；注射用醋酸西曲瑞克高劑量組，給藥濃度 0.05 g /L，致敏劑量 0.083 mg /kg，激發劑量0.167 mg/kg；注射用醋酸西曲瑞克低劑量組，給藥濃度0.025 g /L，致敏劑量 0.042 mg /kg，激發劑量 0.083 mg /kg。隔日每只腹腔注射供試液0.5 mL，共3次。然后將各組再均分為2組，每組3只，分別在首次注射后第14及21日，由耳緣靜脈注射供試液1.0 mL進行激發。每日觀察動物癥狀，首次、末次致敏和激發前稱量動物體重。靜脈注射后30 min內，按表1詳細觀察每只動物的癥狀反應、癥狀出現及消失的時間。最長觀察3 h，并按照評價標準判斷過敏反應發生程度，計算過敏反應發生率，根據過敏反應發生程度和發生率進行綜合判斷。

結果：陰性組和注射用醋酸西曲瑞克高、低劑量組豚鼠均未出現過敏癥狀，而陽性組6只豚鼠在激發后均出現過敏反應，2只為強陽性（＋＋＋），癥狀評分為14分和15分；4只為極強陽性（＋＋＋＋），癥狀評分為20分。

表1 全身主動過敏反應癥狀和評價標準

2.2 被動皮膚過敏性試驗

抗體制備：取健康豚鼠8只，隨機分成4組，每組2只，分組及給藥方法同2.1項。隔日每只腹腔注射供試液0.5 mL，共3次。首次注射后第 14日自心臟采血 5 mL，2 000 r/min，離心 10 min后分離血清，每組2只豚鼠血清合并，分別制得混合抗血清，保存于－20℃環境，備用。

試驗方法：取健康豚鼠24只，隨機分成4組，每組 6只，分別為陰性組、陽性組、高劑量組、低劑量組。動物背部脫毛面積3 cm×4 cm，然后皮內注射各對應組的混合抗血清0.1 mL（稀釋度為1∶4），進行被動致敏。24 h后各組分別耳緣靜脈注射含1%伊文思藍染料的對應供試液1.0 mL，進行激發。30 min后將動物脫臼處死，剪取背部致敏部位皮膚，測量內層藍色反應斑的直徑大小，不規則斑點的直徑為長徑與短徑之和的一半,直徑大于5 mm者判定為陽性。

結果：陰性組和注射用醋酸西曲瑞克高、低劑量組豚鼠均未出現藍斑，為陰性；而陽性組豚鼠皮膚內層藍斑直徑均大于5 mm，分別為 14.58，15.86，15.53，18.29，14.54，17.04 mm，平均15.97 mm，為陽性。

2.3 溶血性試驗[5－8]

紅細胞懸液配制：取健康家兔1只，心臟取血10 mL，放入含玻璃珠的干燥三角瓶中振搖10 min，使成脫纖血液，移入刻度離心管內，加入約 10倍量 0.9%氯化鈉注射液，搖勻，1 500 r/min離心15 min后傾去上清液，沉淀的紅細胞再加0.9%氯化鈉注射液同法反復洗滌2～3次，至上清液無色透明為止。將所得紅細胞用0.9%氯化鈉注射液按其容積稀釋成2%的混懸液，備用。

試驗方法：取潔凈玻璃試管14支進行編號，1～5號管為受試藥物管，7～11號管為參比藥物管，6號管和12號管為供試品對照管，13號管為陰性對照管，14號管為陽性對照管。按表2所示依次加入2%紅細胞懸液、0.9%氯化鈉注射液、純化水、受試藥物（0.062 5 g/L，0.25 g/L 經 1 ∶3 稀釋）、參比藥物（0.062 5 g /L，0.25 g/L 經 1 ∶3 稀釋），混勻，立即置（37±0.5）℃ 的恒溫水浴鍋中進行溫育，觀察是否有溶血和凝聚發生，開始每隔15 min觀察1次，1 h后每隔1 h觀察 1次，最長觀察3 h。

結果：陽性對照管加入純化水后，溶液立即呈澄明紅色，管底幾無紅細胞殘留，表明全溶血；陰性對照管上清液澄明無色，紅細胞全部下沉，經振搖后可均勻分散，顯微鏡下觀察，紅細胞形態正常；3 h時肉眼觀察，受試藥物和參比藥物注射用醋酸西曲瑞克各管紅細胞沉積于試管底部，上層液無色澄明，1號試管壁上有少量紅細胞黏附，經振搖后紅細胞可分散；顯微鏡下觀察，1，2，3，7，8，9號管均有紅細胞聚集現象，1至3號管程度逐漸減輕，總體程度較輕，每個視野內有1～2個兩兩聚集的紅細胞團，滴加氯化鈉注射液后聚集未散，4，5，10，11號管紅細胞形態正常，無聚集現象。結果見表3。

表2 加樣順序

表3 受試藥物溶血性試驗結果

2.4 皮下刺激性試驗[2，7]

方法：取健康家兔4只，試驗前24 h動物背部兩側脫毛，去毛范圍每側各約7 cm×7 cm。采用同體左右側自身對比法，左側背部皮下注射滅菌注射用水，右側背部皮下注射注射用醋酸西曲瑞克 0.1 mg/kg，給藥濃度為 0.25 g /L，給藥容積均為每只1.0 mL。觀察給藥后不同時間注射局部反應情況，注射后48 h處死動物，解剖取出皮下組織，觀察注射部位組織的變化，并進行局部病理組織學檢查。兔皮膚橫切面取材，10%福爾馬林固定，常規脫水包埋，切片4 μm，HE染色。根據肉眼觀察和病理組織學檢查結果進行綜合判斷。

結果：在規定的時間內觀察，家兔皮膚正常，注射部位正常，未見充血、紅腫、變性、壞死等現象。病理檢查結果顯示，受試藥物組兔皮膚結構正常，皮膚內有汗腺、皮脂腺和毛發等，周圍組織無壞死和炎性細胞浸潤，與空白對照組比較，無明顯病理變化。結果見圖 1。

圖1 皮下組織刺激性試驗病理照片（×100）

3 討論

注射藥物安全性評價是藥物臨床前試驗研究的重要組成部分，若有任何一項出現陽性結果，則表明該藥物不符合安全性評價標準，不能供臨床注射使用。注射用醋酸西曲瑞克目前已在中國上市，鮮有發生過敏反應的報道。在此次體外溶血性試驗中，受試藥物和參比藥物高濃度均出現輕微的紅細胞凝聚現象，而低濃度未出現凝聚，凝聚程度和藥物濃度呈正相關。鑒于溶血和凝聚反應發生機制較復雜，藥物的活性成分及其代謝產物、有關物質、輔料、生產工藝及理化性質（如滲透壓、pH等）均有可能引起溶血或凝聚反應的發生，而且凝聚現象的判斷受主觀因素影響比較大，易出現漏洞。因此，在以后的研究中應采用合理的方法和手段，提高溶血性研究的靈敏性和準確性，以避免假陰性或假陽性試驗結果的出現[8－10]。由于目前尚無標準的臨床前體內試驗方法全面評價藥物制劑的溶血反應，因此在長期毒性研究中應該兼顧制劑的溶血性，注意觀察溶血反應的有關指標和體征，以綜合評價藥物的溶血性，并加強臨床應用不良反應的監測，進一步考察注射用醋酸西曲瑞克的安全性，保證臨床用藥安全。

參考文獻：

[1]蔡佳利，陳朝暉，耿蓉霞，等.抗癌藥西曲瑞克應用研究新進展[J].中國實用醫藥，2008，3(3)：1－3.

[2]《化學藥物刺激性、過敏性和溶血性研究技術指導原則》課題研究組.化學藥物刺激性、過敏性和溶血性研究技術指導原則[Z].北京：國家食品藥品監督管理總局，2005.

[3]徐叔云，卞如廉，陳 修.藥理實驗方法學[M].第3版.北京：人民衛生出版社，2002：203，237.

[4]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典(二部)[M].北京：中國醫藥科技出版社，2010：附錄Ⅺ K，L.

[5]陳 奇.中藥藥理研究方法學[M].第2版.北京：人民衛生出版社，2006:157.

[6]《中藥、天然藥物刺激性和溶血性研究的技術指導原則》課題研究組.中藥、天然藥物刺激性和溶血性研究技術指導原則[Z].北京：國家食品藥品監督管理總局，2005.

[7]張廣偉，徐曉月 .注射用氨磷汀安全性研究[J].中國藥業，2011，20(12):19－21.

[8]張德波，馮 誠，羅 潔，等.乳狀液型注射液溶血與凝聚試驗探討[J].中國藥品標準，2006，7(5):51－53.

[9]黃應賢，巢 琪.300種中西藥注射劑的體外溶血試驗[J].中國藥學雜志，1985，20(2):77－79.

[10] 雪濤，李 剛，孫振平.對23種中藥注射劑溶血與凝聚檢查的探討[J].中國藥品標準，2010，11(6):430－432.