高效液相色譜法檢測苯甲酸阿格列汀對映異構體的含量

邱思婕，郭燕玲

（廣東先強藥業股份有限公司，廣東 廣州 510000）

苯甲酸阿格列汀（alogliptin benzoate）為絲氨酸蛋白酶二肽基肽酶Ⅳ（DPP-Ⅳ）抑制劑，化學名為（R）-2- ［（6- （3-氨基哌啶 -1-基）-3-甲基 -2，4-二氧代 -3，4-二氫嘧啶 -1（2H）-基）甲基］芐腈苯甲酸，2010年4月首次在日本獲批上市［1-2］。該藥分子中含有手性中心，因此有必要建立對映異構體的測定方法。為此，筆者建立了測定苯甲酸阿格列汀對映異構體的高效液相色譜法，方法準確可靠、簡便、靈敏度高，現報道如下。

1 儀器與試藥

Agilent1260型高效液相色譜儀（美國Agilent公司），BT125D型分析天平（德國賽多利斯公司）。苯甲酸阿格列汀對映異構體對照品（純度為99%，批號為121101S），苯甲酸阿格列汀對照品（純度為 99%，批號為 121101），苯甲酸阿格列汀（批號分別為121201，121202，121203）均由廣東先強藥業股份有限公司提供；正己烷、乙醇為色譜純，二乙胺為分析純。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱：Chiralcel OJ-H 手性柱（250 mm×4.6 mm，5μm）；流動相：正己烷 -乙醇 -二乙胺（60∶40∶0.1）；檢測波長：225 nm；流速：0.8mL /min；柱溫：25 ℃ ；進樣量：20 μL。

2.2 溶液制備

精密稱取苯甲酸阿格列汀對映異構體適量，加流動相溶解并稀釋至刻度，搖勻，制成每1mL約含阿格列汀對映異構體50μg的溶液，即得對映異構體貯備液。

精密量取對映異構體貯備液適量，加流動相溶解并稀釋至刻度，搖勻，制成每1mL約含阿格列汀對映異構體0.5μg的溶液，即得對照品溶液。

精密稱取苯甲酸阿格列汀適量，加流動相溶解并稀釋至刻度，搖勻，制成每1mL約含阿格列汀100μg的溶液，即得供試品溶液。

精密稱取苯甲酸阿格列汀對照品和苯甲酸阿格列汀對映異構體對照品適量，加流動相溶解并稀釋至刻度，搖勻，制成每1mL約含阿格列汀及其對映異構體各20μg的溶液，即得系統適用性溶液。

2.3 方法學考察

系統適用性試驗：精密吸取對照品溶液20μL注入液相色譜儀，調節檢測靈敏度，使主成分色譜峰的峰高為滿量程的10%～20% 。精密吸取系統適用性溶液20μL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖。阿格列汀與對映異構體的保留時間約為12 min和19min，分離度大于2.0，理論板數均大于2 500。

檢測限考察：精密量取對映異構體貯備液，按倍比稀釋法稀釋，取稀釋后溶液，分別進樣20μL，記錄色譜圖。按信噪比S/N＝3計算，檢測限約為1.02 ng。

定量限考察：精密量取對映異構體貯備液，按倍比稀釋法稀釋，取稀釋后溶液，分別進樣20μL，記錄色譜圖。按信噪比S/N＝10計算，定量限約為3.06 ng。

線性關系考察：精密稱取對映異構體對照品適量，加流動相溶解并稀釋成含阿格列汀對映異構體0.15，0.30，0.50，0.60，0.75μg/mL的溶液，分別進樣20μL，以進樣質量濃度為橫坐標、阿格列汀對映異構體峰面積為縱坐標進行線性回歸，線性方程為 Y＝143.35X+0.297 9，r2＝0.999 7（n＝5）。結果表明，對映異構體質量濃度在0.15～0.75μg/mL范圍內與峰面積呈良好線性關系。

準確度考察：取苯甲酸阿格列汀約13.6mg（未檢出對映異構體），共9份，每3份分別加入對映異構體貯備液0.8，1.0，1.2mL，用流動相稀釋至100mL，搖勻。分別進樣20μL，以外標法計算加入量，結果見表1。

精密度試驗：取對映異構體對照品溶液，進樣6次，記錄色譜圖。結果對映異構體峰面積的 RSD＝0.5%（n＝6），表明儀器精密度良好。

2.4 樣品檢測

取3批供試品，照2.1項下的方法配制供試品溶液、對照品溶液。按2.2項下色譜條件進行測定，記錄色譜圖，按外標法計算對映異構體含量。3批供試品中均未檢出對映異構體。

表1 準確度考察結果（n＝9）

3 討論

色譜柱的選擇：本試驗采用2種色譜柱即Chiralpak IC和Chiralcel OJ-H手性柱對異構體進行拆分。結果顯示，使用Chiralcel OJ-H手性柱時，保留時間較短，分離效果好，柱效較高，因此確定為本試驗用色譜柱。該色譜柱的固定相為表面涂敷了手性多聚物（直鏈淀粉或纖維素衍生物）的球型硅膠，是目前通用性最廣的正相手性色譜柱之一。

測定波長的選擇：通過紫外光譜掃描，苯甲酸阿格列汀對映異構體在225 nm和277 nm波長處有最大吸收，但在277 nm波長處苯甲酸吸收較強，故測定波長定為225 nm。

流動相的選擇：在試驗過程中，通過調整正己烷-乙醇的比例，使阿格列汀與其對映異構體之間能達到分離要求。綜合考慮分析時間、柱壓、分離度等因素，最后確定為正己烷-乙醇（60∶40）。在此條件下，對二乙胺的濃度進行考察，結果表明二乙胺的濃度對分離幾乎無影響，但可改善峰形、減小拖尾。因此，確定流動相為正己烷-乙醇-二乙胺（60∶40∶0.1）。

參考文獻：

［1］王 珊，范 鳴 .抗 2型糖尿病藥物-Alogliptin［J］.藥學進展，2008，32（7）：326-327.

［2］張淑芳.治療糖尿病的新藥NESINA獲批在日本上市［J］.中國執業藥師，2010，12（6）：54.