研究酶比色法與HPLC法測定血清同型半胱氨酸的相關性

摘要：目的 探究分析甘油三脂試劑盒（酶比色法）和高效液相色譜法（又稱高效液相層析，簡稱HPLC）在測定血清中的同型半胱氨酸（Hcy）的相關性。方法 隨機選取10份臨床的血清樣本，分別運用甘油三脂試劑盒（酶比色法）檢測法與高效液相色譜法對每一份血清樣本進行Hcy濃度的測定，并分析和評價運用兩種不同測定方法，檢測所得結果兩者之間的相關系數。結果 甘油三脂試劑盒（酶比色法）檢測法與高效液相色譜法檢測血清樣本同型半朧氨酸結果的相關系數為R2=0.9978。結論 甘油三脂試劑盒（酶比色法）檢測法與高效液相色譜法在測定血清中的同型半胱氨酸具有明顯的一致性。

關鍵詞：酶比色法；甘油三脂試劑盒；高效液相色譜法；同型半朧氨酸；相關性

同型半胱氨酸又稱為高半胱氨酸，它是人體內部蛋氨酸在新陳代謝和循環過程中產生的，并且其內部含有一種名為硫氨基酸的物質，是人體進行新生代謝和實現需甲基化反應不可或缺的中間產物，是硫氨基酸的一種形式[1]。目前醫學臨床測定同型半朧氨酸主要有循環酶法和放射免疫方法、甘油三脂試劑盒檢測法和熒光偏振免疫評價分析方法和高效液相色譜法等。因為高效液相色譜法在測定血漿內的同型半胱氨酸濃度時，顯現出更高的靈敏度和特異性，是目前醫學臨床測定血漿內的同型半胱氨酸濃度首要選擇的測定方法。此次研究主要通過對比分析甘油三脂試劑盒（酶比色法）檢測法和高效液相色譜法在測定血清中的同型半朧氨酸的重要相關性，研究的時間為2012年8月～2013年8月，現將此次研究作如下報告。

1 試劑和儀器

1.1試劑 采用的甘油三脂試劑盒用于檢測同型半朧氨酸濃度是產于重慶市中元生物科技有限公司；同型半朧氨酸、三氯乙基磷酸酯阻燃增塑劑和SBDZF均是從Sigma公司采購。甲醇（methyl alcohol）的色譜純主要是采用美國天地公司生產；EDAT·ZK、磷酸二氫鉀、四硼酸鈉、三氯乙酸、正磷酸等其他檢測試劑都是中國生產的分析純。

1.2儀器 此次對比研究分析主要采用的儀器有島津LC-10AVP高效液相色譜儀、保護柱和C18柱芯、分析天平、日立7180全自動生化分析儀、TU-1901紫外分光光度儀。

1.3血清樣本 20份血清樣本取自于某市某區某醫院的檢查科，采用甘油三脂試劑盒用于檢測同型半朧氨酸濃度是產于重慶市中元生物科技有限公司在日立7180全自動生化分析儀對Hcy濃度進行測定。

2 方法

2.1酶比色法 采用甘油三脂試劑盒（酶比色法）檢測同型半朧氨酸濃度，是產于重慶市中元生物科技有限公司。通過采用二硫蘇糖醇（DTT）還原血清樣本中氧化型Hcy，其次通過Hcy甲基轉移酶的反映和作用，把D-甲硫氨酸中的甲基分化轉移到Hcy，從而生成D一蛋氨酸以及L-蛋氨酸。之后D-蛋基酸通過D-蛋氨酸中氧化的作用之下生成雙氧水。雙氧水和顯色試劑10-3.7-雙吩噻嗪鈉互相作用，并生成亞甲藍，并分貝測定他們吸收廣度的不同變化。具體操作方法為：兩份血清樣本（樣本ΔEA和樣本ΔEB）和兩組各位兩份的校準樣品（ΔES1A/ΔES1B/ΔES2A/ES2B），并將試劑RIA樣本（ΔEA、ΔEB）和校準樣品量（ΔES1A/ΔES1B/ΔES2A/ES2B）定為180、0、180、0、180、0；試劑RIB的樣本ΔEA、ΔEB）和校準樣品量（ΔES1A/ΔES1B/ΔES2A/ES2B）定為0、180、0、180、0、180。將樣品和校準品混合均勻之后，于37度環境下保溫5min，完成后測定其吸光度。計算方法為：Hcy濃度（μmol/L）=[校準品2標示值×（ΔEA-ΔES1A）/（ΔES2A-ΔES1B）]-[校準品2標示值×（ΔEB-ΔES1B）/（ES2B-ES1B）]。Hcy檢測試劑盒主要采用產于重慶市中元生物科技有限公司的甘油三脂試劑盒（酶比色法）檢測血清樣本，并按照上述的操作方法在某市某區某醫院的檢驗科通過日立7180全自動生化分析儀結束檢測。

2.2HPLC法 色譜條件為：激發波長是380nm，發射波長是510nm。流動相：A相采用的是pH值為3.0且濃度為25mmol/L的磷酸鹽緩沖液；B相采用的是甲醇（methyl alcohol）。并按照如下梯度的洗脫流程進行，B相的體積比那戶范圍是0～9min，5%～10%；9～10min，柱溫保持為30度，流速為：1ml/min。

樣品的預處理和測定：將三（2-氯乙基）磷酸酯作為還原劑，SBD-F作為衍生劑，C18柱進行分離，NAC為內標，根據內標標準的曲線法對血清樣本進行評價和分析。

2.3統計學方法 應用SPSS.13軟件進行分析，將酶比色法和高效液相色譜法所測得的數值進行平均值和標準差，并根據計算方法算得t值<0.05，P>0.05則表明兩種測定結果的比較無顯著差異。

相關性的計算：將酶比色法和高效液相色譜法所測得數值給予回歸分析，并計算系數r，所得結果應為r≥0.95，兩組測定數值呈明顯的正線性相關。

3 結果

采用酶比色法檢測10份血清樣本的結果顯示為：1～10份血清樣本的測定濃度是[30.2、6.2、9.0、11.0、23.1、66.3、45.1、40.3、30.2、11.6（μmol/L）]；采用高效液相色譜法檢測血清樣本的結果顯示為：1-20份血清樣本的測定濃度是[33.8、7.0、10.5、12.5、29.6、72.4、48.2、48.8、34.5、13.9（μmol/L）]；甘油三脂試劑盒（酶比色法）檢測法與高效液相色譜法檢測血清樣本同型半朧氨酸相關性結果的相關系數為R2=0.9978，兩種檢測方法在檢測血清中同型半朧氨酸的相關性具有顯著的一致性。

4 討論

同型半胱氨酸是在1932年被發現的，其分子結構式為HSCH2（NH2）CO2H，根據流行病學和大量的臨床實驗結果顯示，高含量的同型半胱氨酸和腦血管疾病、冠狀動脈的疾病等存在著密不可分的關系[2]。人體血液中的同型半胱氨酸主要以同型半朧氨酸二硫化物和同型半朧氨酸以及朧氨酸一同型半朧氨酸這三種形式存在。正常的人體內部會含有微量的Hcy存在，其大多是以和白蛋白共存結合的形式存在，還原型的Hcy僅占其總量的2%。Hcy的正常參考值隨測定方法和種族人群的不同而有所不同，一般正?？崭寡獫{總Hcy水平為5～15μmol/L。研究表明：Hcy每升高5umol/L腦卒中風險升高59%，缺血性心臟病風險升高32%。此次研究通過對比分析酶比色法和高效液相色譜法用于檢測血清中Hcy相關性結果良好，表明通過全自動的分析儀器，及時采用酶比色法進行測定血清中的Hcy濃度，具有消耗檢測試劑和血清標本少，操作方法簡單，且取得準確的檢測結果，是臨床早期發現和診治Hcy相關疾病的重要方法。

參考文獻：

[1]張志強，李君義.同型半胱氨酸與冠心病的相關性研究進展[J].國際檢驗醫學雜志，2013，4（04）：11-12.

[2]李進，張衛，鄧靜嬪等.葉酸、維生素B6、維生素B12對冠心病的二級預防作用[J].中國老年學雜志，2012，1（01）：56-59.

編輯/王敏