奧硝唑氯化鈉注射液無菌檢查方法建立

摘要：奧硝唑在體內主要以具有細胞毒作用的原藥和具有細胞毒作用的中間代謝活性產物，作用于厭氧菌、阿米巴蟲、賈滴蟲和毛滴蟲細胞的DNA，使其螺旋結構段裂或阻斷其轉錄復制而至其死亡，達到抗菌抗原生質的目的。目的 建立適宜的奧硝唑氯化鈉注射液無菌檢查方法，對所建立方法進行方法學驗證，確認所建立的檢查方法適合本品無菌檢查，使藥品質量得到有效控制。方法 采用薄膜過濾，探索該制劑的無菌檢查方法。結果 所建立的無菌檢查方法適用于奧硝唑氯化鈉注射液的無菌檢查。

關鍵詞：方法學驗證 奧硝唑氯化鈉注射液 薄膜過濾法

中圖分類號：R927 文獻標識碼：A 文章編號：1674-098X（2015）04（a）-0000-00

奧硝唑在體內主要以具有細胞毒作用的原藥和具有細胞毒作用的中間代謝活性產物，作用于厭氧菌、阿米巴蟲、賈滴蟲和毛滴蟲細胞的DNA，使其螺旋結構段裂或阻斷其轉錄復制而至其死亡，達到抗菌抗原生質的目的。依據《中國藥典》無菌檢查相關規定及參閱相關文獻[1-6]，本文采用薄膜過濾法對奧硝唑氯化鈉注射液進行無菌方法驗證，確定本品檢驗方法及檢驗條件。

1.材料與儀器

1.1 試藥

奧硝唑氯化鈉注射液，規格：100ml：奧硝唑0.25g與氯化鈉0.9g，四川科倫藥業股份有限公司

1.2 儀器

HTY-2000B 型智能集菌儀 杭州泰林生物技術有限公司，SW-CJ 超凈工作臺 蘇州凈化設備有限公司，BSC-1000B型生物安全柜 北京東林哈爾儀器有限公司，LRH型生物培養箱 上海一恒科技有限公司。

1.3 驗證用菌株

金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌、生孢梭菌、白色念珠菌、黑曲霉菌，以上菌種由中檢所提供。

1.4 培養基

營養肉湯培養基（批號：140110）、營養瓊脂培養基（批號：140303）、玫瑰紅鈉瓊脂培養基（批號：140706）、硫乙醇酸鹽流體培養基（批號：140711）、改良馬丁培養基（批號：140641）。

2.方法與結果

2.1 實驗環境

在B級下局部A級的單向流區域內進行，實驗過程中嚴格按照無菌操作，防止微生物污染。

2.2 接種及菌液制備

取金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、銅綠假單胞菌斜面培養物至營養肉湯中，于30℃培養。取白色念珠菌斜面培養物至改良馬丁培養基中，于25℃培養。另取生孢梭菌液體培養物至硫乙醇酸鹽流體培養基中，于35℃培養。

取經35℃培養的金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌營養肉湯培養物各1ml及生孢梭菌硫乙醇培養物1ml分別加入到9ml的營養肉湯中，依次稀釋，枯草芽孢桿菌至10-5，金黃色葡萄球菌至10-6，銅綠假單胞菌至10-7，生孢梭菌至10-6。 取經25.8℃培養24小時的白色念珠菌改良馬丁培養物1ml，加至營養肉湯中，依次稀釋至10-6。取經培養5天的黑曲霉斜面培養物，加3ml營養肉湯洗下孢子依次稀釋至10-4，備用。上述各菌株的培養物均為第二代培養物。

2.3 方法驗證

按照《中國藥典》2010版藥典無菌檢查項下方法，每種培養基過濾樣品10瓶。用0.1%蛋白胨水溶液沖洗，每筒總沖洗量為500ml，每次100ml。分別加入已制備好的上述各菌液1ml，過濾，向金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌、生孢梭菌筒內分別加入硫乙醇酸鹽流體培養基。32～35℃培養5天，逐日觀察，向白色念珠菌、黑曲霉筒內分別加入改良馬丁培養基，25～28℃培養5天，逐日觀察。另取6個筒，4筒分別加入上述已制備好的金萄菌、銅綠假單胞菌、枯草桿菌、生孢梭菌菌液，分別加入硫乙醇酸鹽流體培養基。32～35℃培養5天，逐日觀察，向另2個筒分別加入白色念珠菌及黑曲霉菌液各1ml，分別加入100ml改良馬丁培養基，25～28℃培養5天，逐日觀察。

供試品對照組：取供試品，共制備2組。用適量沖洗液潤濕濾膜，將供試品過濾。用0.1%蛋白胨水溶液沖洗，每筒總沖洗量為500ml，每次100ml。每次沖洗到一半時，晃動杯壁，沖洗完畢，向2個筒分別加入硫乙醇酸鹽流體培養基和改良馬丁培養基各100ml，25～28℃培養5天，逐日觀察。陰性對照：取0.1%蛋白胨水溶液適量，置入兩個濾筒中過濾，分別加入硫乙醇酸鹽流體培養基和改良馬丁培養基各100ml，25～28℃培養5天，逐日觀察。空白對照：取2個筒，將硫乙醇酸鹽流體培養基和改良馬丁培養基分別加入到筒中，25～28℃培養5天，逐日觀察。取制備好的金葡色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌、生孢梭菌菌液各1ml于濾筒中，加適量沖洗液沖洗，取出濾膜，菌面朝上，貼于營養瓊脂培養基平皿上，30～35℃培養48h。黑曲霉菌菌液1ml于平皿中。傾注玫瑰紅鈉瓊脂培養基10ml，于25～28℃培養72h。

2.4 結果

活菌計數見表1（說明：如不附表，可將該句話和表刪掉），與對照組比較，含供試品的各濾筒中試驗菌均生長良好，并與各對照組中相應菌生長情況相似。供試品對照組、陰性對照組和空白對照組均無菌落生長。供試品采用濾膜過濾法檢查，在此檢驗量和沖洗量的檢驗條件下無抑菌作用。因此，可照此檢查法和檢查條件檢查奧硝唑氯化鈉注射液的無菌檢驗。

3.討論

薄膜過濾法為《中國藥典》收載的無菌檢查方法中的檢驗方法之一，采用封閉的薄膜過濾器，把細菌等微生物截留在濾膜上，經過對培養基的培養，使微生物能被檢出，檢查過程中需嚴格遵守無菌檢查操作規程。在實驗過程中注意使供試品溶液覆蓋濾膜整個表面，根據試驗結果確定奧硝唑氯化鈉注射液無菌檢查方法，采用薄膜過濾法檢查，每種培養基過濾樣品10瓶，全量過濾，經過驗證，各實驗菌生長良好。可按照此檢查方法對奧硝唑氯化鈉注射液進行無菌檢查。

參考文獻

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[5]李玉芹. 淺談目前無菌檢查和微生物限度檢查存在的問題. 中國藥事，2007年第21卷12期：1011.

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