岡雜棉 8號SSR數字指紋圖譜的構建

摘要：利用32對SSR引物對岡雜棉8號及其親本進行多態性檢測，共有13對引物在2個親本間具有多態性，這些引物在兩親本間擴增出大小不同的帶，且這些標記位點在F1中均表現為雜合帶，為共顯性標記。將這13對引物在親本和雜交種間擴增檢測得到的01帶型數據轉換成十進制數據，構建了岡雜棉8號及其親本的數字指紋圖譜，為雜交種的真偽鑒定和純度檢測提供了方法。采用多對引物構建的雜交棉數字指紋圖譜，能為岡雜棉8號的真偽鑒定、純度檢測及親本提純等工作提供更加準確的技術指導。

關鍵詞：岡雜棉8號；SSR；數字指紋圖譜

中圖分類號：S562∶Q789 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2015）09-2057-04

棉花是常異花授粉作物，在良種繁育過程中常常出現品種退化現象，在人工制種過程中，因母本去雄不徹底或漏去雄而形成的自交鈴會嚴重影響雜交種純度，種子的混雜不僅影響產量，也會導致品質的不一致，因此高純度的雜交種是棉花獲得高產優質的基本保障[1]?？焖?、準確而高效的純度鑒定對雜交棉品種的推廣應用具有重要的現實意義。常規的純度鑒定多是利用形態性狀或（和）生理生化性狀等，受環境影響大，并且鑒定周期長[2]。DNA分子標記技術直接檢測基因組DNA之間的多態性，不受栽培條件、生態環境和生長發育階段等因素的影響，并且可以在全生育期的任何階段進行檢測，包括種子也可以進行檢測。SSR（Simple sequence repeat）標記具有數量豐富，分布于整個基因組，等位變異高，多數共顯性遺傳，重復性好，特異性強，結果穩定可靠等優點，在遺傳作圖、QTL定位、遺傳多樣性、關聯作圖及品種鑒定方面得到了廣泛應用[3]。分子指紋圖譜的研究工作在水稻[4]、玉米[5]、小麥[6]等多個作物上得到應用。

在棉花上，經前人鑒定，在眾多的SSR引物中選擇了多態性、穩定性、重復性等綜合特性好的引物作為棉花品種資源鑒定和分子指紋分析的核心引物[7，8]。殷劍美等[9]篩選了217對SSR引物，共有12對引物在兩個親本間具有多態性，構建雜交棉蘇雜118的SSR指紋圖譜，為該品種的真偽鑒定和純度檢測提供了分子學依據。潘兆娥等[10]利用25對核心引物對中棉所48及其親本進行多態性檢測，有14對引物在兩親本間擴增出大小不同的帶，且這些標記位點在F1中均表現為雜合帶，為共顯性標記；構建了中棉所48的數字指紋圖譜，為雜交種的真偽鑒定和純度檢測提供了方法。

岡雜棉8號是湖北省黃岡市農業科學院、湖北省農業科技創新中心鄂東南綜合試驗站用岡173-6為母本、岡19-28為父本配組選育而成，2008年3月通過湖北省農作物品種審定委員會審定（審定編號鄂審棉2008005），因豐產穩產性好，深受廣大棉農的喜愛[11-13]。為建立岡雜棉8號快速鑒定技術，利用SSR分子標記技術，根據已篩選和鑒定出的核心引物，構建了岡雜棉8號及其親本的DNA指紋圖譜，為該品種的權益保護、真偽鑒別、雜種純度鑒定和親本提純等提供理論依據和技術指導。

1 材料與方法

1.1 材料

雜交棉品種岡雜棉8號、母本岡173-6、父本岡19-28及用于純度鑒定的雜交種F1均由湖北盛豐科技有限公司提供。

1.2 引物序列信息

根據岡雜棉8號親本來源，參考前人在構建棉花指紋圖譜及品種鑒定上使用的核心引物，選擇了32對SSR核心引物用于DNA指紋圖譜的構建[7]，SSR引物序列來源于Cotton CMD數據庫[14]，引物由上海博亞生物技術有限公司合成，引物具體信息見表1。

1.3 棉花基因組DNA的提取

田間取棉花幼嫩葉片，采用CTAB法提取所有試驗材料的總DNA，棉花葉片基因組總DNA的分離和純化參考Paterson等[15]的方法，提取的DNA用TE（Tris-EDTA ddH2O）溶解，利用賽默飛公司Thermo Scientific NanoDrop 2000超微量分光光度計對DNA樣品進行質量測定及濃度定量，-20 ℃保存備用。

1.4 PCR反應體系

將樣品DNA溶液用滅菌雙蒸水稀釋至10 ng/μL。PCR應體系為：模板3 μL，正向引物（2U/mol） 2.5 ？滋L，反向引物（2 U/mol）2.5 ？滋L，dNTPs（10 mol/L）0.5 ？滋L，10×Buffer 2.5 ？滋L ，Taq酶0.5 U，補充ddH2O至25 ？滋L。擴增儀器型號為Bio-Rad Mycycler，反應程序為：95 ℃預變性5 min；94 ℃變性50 s，56℃退火45 s ，72 ℃延伸1 min， 34次循環；72 ℃延伸5 min。

1.5 PCR 產物的檢測

SSR擴增產物用6%的變性聚丙烯酰胺凝膠檢測。電泳槽為北京市六一儀器廠DYCZ-30型電泳槽，在15W恒功率電泳180 min左右，緩沖液為1×TBE，點樣量為每孔3.5 μL。電泳后的銀染法步驟：固定56 min；滲透12 min左右；ddH2O洗30 s；加入顯色液，輕搖至DNA條帶顯出為止；ddH2O洗 1～2 次；加入終止液終止反應；統計帶型并照相。

1.6 數據統計與SSR分析

標記的數據記錄根據電泳結果采用0、1系統描述條帶的相對位置，條帶清晰的記為1，缺失的則記為0，依據分子質量從小到大的順序讀帶，不具多態性的條帶不予統計。然后，將每對引物在品種間擴增得到的01（二進制）數據轉換成十進制數據，以位數最多的十進制數為標準，位數不夠的在數字前面加0補成相同的數字位數，用該十進制數代表每個引物的擴增結果，用多個引物的十進制數據組合成數字串作為該材料的數字指紋。

2 結果與分析

2.1 岡雜棉8號父母本的多態性檢測

利用32對核心引物對岡雜棉8號及其親本等3個材料進行分子多態性檢測，其中有13對引物在兩親本間擴增出不同帶型，說明這些引物在兩個親本間具有多態性。這13對引物分別為NAU1102、MUCS101、HAU1300、MGHES-44、NAU934、MON_CGR6410、Gh277、NAU1200、NAU1362、MON_SHIN-0376、NAU859、HAU2026、NAU1233，由親本間帶型可知這13對引物的標記位點在F1中均表現為雜合帶型（圖1，以引物MUCS101為例），為共顯性標記，這些標記位點可清楚地區分父本母本及F1，因此可以直接用于岡雜棉8號雜交種的純度鑒定。

2.2 雜交種及其親本SSR數字指紋圖譜的構建

利用13對共顯性引物對岡雜棉8號及其親本材料進行基因型分析，獲得的條帶數據為01帶型記錄，隨后將二進制（01）數據轉換為十進制數據（表2）。如NAU1102在母本中的讀帶結果為011，將此二進制數轉換為十進制數為3，在父本中的讀帶結果為101，將此二進制數轉換為十進制數為5。用這13對引物組成的十進制數字串分別代表親本及其雜種的數字指紋代碼，這些數字代碼分別對應于相應的SSR引物編碼，可以作為岡雜棉8號及其親本的分子身份證，為真偽雜交種的辨別及親本的提純復壯等工作提供指導。

2.3 雜交種純度鑒定

通過多態性檢驗，獲得了13對共顯性標記，理論上其中任何一對都可用于岡雜棉8號雜交種的純度鑒定。對制種基地某農戶提供的樣品進行隨機抽樣，抽取樣品種子100粒，采用引物MUCS101對樣本和親本進行了純度鑒定，從擴增的帶型來看，100粒種子中與父本帶型相同的有5株，1株帶型與母本相同，其余的與F1帶型相同，根據該引物檢測結果，在樣品中F1帶型的檢出率為94%。

3 結論與討論

雜種優勢利用是棉花育種的有效手段之一，近年來轉基因抗蟲雜交棉在生產上得到了廣泛的應用[16]。隨著產量水平的提高，育種單位的增多，生產上應用的雜交種也不斷增多，但是由于棉花遺傳基礎狹窄，雜交種種間同質性程度高，種間差異越來越小，并且形態差異多數受環境影響，品種的純度檢測和真實性鑒定都遇到了難題[17]。

SSR標記是目前廣泛應用的分子標記技術之一，一般呈共顯性遺傳，具有重復性好，多態性豐富等特點，用于棉花雜交種純度鑒定具有很大的優越性。

目前棉花雜交種的制種一般都是采取人工去雄的方法，人工去雄技術是否規范直接影響雜交種種子的純度，制種過程中漏去雄、去雄不徹底或母本花藥粘著苞葉使柱頭造成串粉等情況常常導致母本自交成鈴，同時父母本混雜種植制種，在收獲過程中也可能引起父本混雜[18]。雜交種的純度不僅關系到經營企業的聲譽和利益，還關系到棉花產量，影響棉農收益。

由于棉種間形態差異較小，田間鑒定準確度較差，一般僅能根據抗蟲基因的后代分離進行鑒定[19]，因此構建分子指紋圖譜技術將簡化鑒定流程，縮短鑒定時間，有利于及時快速了解種子的純度及真實性情況。

本研究利用32對核心引物對岡雜棉8號及其親本進行多態性檢測，共有13對引物在2個親本間具有多態性，這些引物在兩親本間擴增出大小不同的帶，且這些標記位點在F1中均表現為雜合帶，為共顯性標記。將這13對引物在不同材料間擴增得到的01（二進制）數據轉換成十進制數據，構建了岡雜棉8號的數字指紋圖譜，為雜交種的真偽鑒定和純度檢測提供參考。

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