芳香化酶抑制劑對(duì)中華條頸龜性別分化的影響

摘要：為研究芳香化酶抑制劑（Aromatase inhibitor，AI）Letrozole對(duì)中華條頸龜（Mauremys sinensis）性別分化的影響，在（30.0±0.5） ℃下孵化受精卵，孵化20 d時(shí)涂抹不同質(zhì)量濃度Letrozole，出殼稚龜暫養(yǎng)1周后進(jìn)行性別鑒定。結(jié)果表明，去離子水對(duì)照組孵化子代稚龜雌性占63.64%，雄性和間性各占13.6%和22.73%，差異極顯著（P<0.01），說(shuō)明該溫度下，中華條頸龜主要產(chǎn)雌性個(gè)體；AI處理組雄性率分別為88.89%、92.00%和95.00%，說(shuō)明誘導(dǎo)雄性轉(zhuǎn)化作用較強(qiáng)（P<0.01），并且乙醇處理組和AI處理組均不會(huì)影響龜卵的孵化率（P>0.05）和孵化期（P>0.05）。對(duì)AI處理組的性腺進(jìn)行組織學(xué)觀察，雌轉(zhuǎn)雄精巢曲細(xì)精管發(fā)育良好，組織結(jié)構(gòu)典型；未完全雄性化的卵睪體，髓質(zhì)有少量發(fā)育完整的曲細(xì)精管，皮層退化成薄薄的一層，組織結(jié)構(gòu)處于睪丸與卵巢之間。在產(chǎn)雌溫度下， 性分化前使用AI能較好地誘導(dǎo)中華條頸龜由雌性轉(zhuǎn)為雄性。

關(guān)鍵詞：中華條頸龜（Mauremys sinensis）；芳香化酶抑制劑；性腺；性別分化

中圖分類號(hào)：Q45；Q959.6+3 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2015）06-1430-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.06.037

Abstract：In order to study effect of aromatase inhibitor on sex differetiation of Mauremys sinensis， eggs were daubed under 30.0±0.5 ℃ with aromatase inhibitors（Letrozole） in the 20th day of the hatching period. Sex identification of hatched hatchlings were carried out after holding one week. The results showed that female of hatched offspring was 63.64%， male and intersexual was 13.64% and 22.73% with the significant difference（P<0.01）. Mauremys sinensis produced mainly females. Among the three AI-treated groups，male rates were 88.89%，92.00% and 95.00% respectively. The 95% ethanol treated group and three AI-treated groups did not affect the turtle eggs hatching rate （P>0.05） and incubation period （P>0.05）. Histological observation of the gonads of the AI-treated group showed that female turn to male testes seminiferous tubules well developed and organizational structure was typical. There was incomplete masculinization of ovotestis body. A small amount of growth medulla completed seminiferous tubules. Cortical degraded into a thin layer between the or ganizational structure between the testis and ovary. It will provide important and useful information for husbandry and management of the M.sinensis.

Key words： Mauremys sinensis； aromatase inhibitor； sex gonad； sex differentiation

龜鱉動(dòng)物性別決定模式主要為溫度依賴型性別決定機(jī)制（Temperature-dependent sex determination，TSD），即性別分化取決于胚胎發(fā)育過(guò)程中溫度敏感期（Temperature sensitive period，TSP）的環(huán)境溫度高低[1]。不利的環(huán)境溫度能夠干擾龜類孵化和性比，性比失調(diào)可能使很多物種成為瀕危保護(hù)動(dòng)物，甚至導(dǎo)致動(dòng)物種群的衰落或滅亡[2]。在龜鱉類資源嚴(yán)重破壞的現(xiàn)狀下，通過(guò)飼養(yǎng)繁殖，使用有效方法控制龜類性別分化，能提高繁育率。在養(yǎng)殖條件下控制龜類性比，通常采取調(diào)節(jié)孵化溫度方法，如有些龜類低溫產(chǎn)雄性、高溫產(chǎn)雌性[3-5]，或通過(guò)外源激素或內(nèi)源激素調(diào)控改變龜類性別。外源雌激素（雌二醇 E2）處理孵化卵，可以誘導(dǎo)雄性溫度條件下的胚胎發(fā)育成雌性，但外源雄激素睪酮T處理卻不能誘導(dǎo)雌性溫度條件下孵化的卵發(fā)育成雄性，因?yàn)樾奂に豑被芳香化酶（Aromatase）催化后轉(zhuǎn)換成了雌激素E2[6]。AI可以抑制芳香化酶的活性，從而阻止雌二醇的合成，實(shí)現(xiàn)龜類性別的轉(zhuǎn)化，將雌性轉(zhuǎn)為雄性，該作用僅發(fā)生在基準(zhǔn)溫度下[7，8]。AI在動(dòng)物性別控制相關(guān)領(lǐng)域有一定研究，如對(duì)番鴨性腺分化的研究[9-11]，魚(yú)類性別逆轉(zhuǎn)的研究[12，13]等。

中華條頸龜（Mauremys sinensis）作為本土龜類，主要分布在海南、臺(tái)灣等地，由于過(guò)度獵捕和棲息環(huán)境破壞等原因，野生種群數(shù)量銳減，其已被列為瀕危物種[14]。2009年容銀燕等[15]對(duì)中華條頸龜性別決定機(jī)制進(jìn)行初步研究，確定其屬于TSD機(jī)制，低溫主要產(chǎn)雄性，孵化率低；高溫主要產(chǎn)雌性，孵化率高。因此，本研究在高溫（產(chǎn)雌性個(gè)體）條件下孵化，于溫度敏感期采用AI處理胚胎，研究AI對(duì)中華條頸龜性別分化的影響，為解決瀕危龜類物種人工繁育問(wèn)題提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)開(kāi)展于2010和2011年中華條頸龜繁殖季節(jié)4～6月，試驗(yàn)用卵為產(chǎn)出2～3 d的受精卵，胚盤(pán)明顯、正常，全部購(gòu)自海南省文昌長(zhǎng)壽園龜類養(yǎng)殖基地。

1.2 試驗(yàn)藥品

試驗(yàn)所用芳香化酶抑制劑來(lái)曲唑（Letrozole，Let）片劑為瑞士Novartis產(chǎn)品， 以95%乙醇溶液作為助溶劑， 配制3個(gè)不同質(zhì)量濃度梯度（5、 10、 20 μg/μL）。

1.3 人工孵化和AI處理

試驗(yàn)前采用1∶5 000高錳酸鉀溶液浸泡孵化箱、擦拭培養(yǎng)箱。試驗(yàn)設(shè)置5個(gè)分組：空白對(duì)照組（去離子水）、95%乙醇、5 μg/μL AI、10 μg/μL AI、20 μg/μL AI，受精卵隨機(jī)分組，每組30枚，每個(gè)孵化箱15枚，并設(shè)置兩個(gè)平行組。孵化第21天（TSP）使用不同質(zhì)量濃度Let各5 μL涂抹受精卵，兩個(gè)對(duì)照組進(jìn)行同樣處理。孵化箱（22 cm×16 cm×9 cm）底鋪5 cm蛭石，放入受精卵，水平間隔0.5～1.0 cm依次排放，覆蓋2 cm蛭石。試驗(yàn)設(shè)置孵化溫度（30.0±0.5） ℃，保持智能生化培養(yǎng)箱（型號(hào)HWS-250，寧波海曙賽福實(shí)驗(yàn)儀器廠）空氣相對(duì)濕度為85%～90%，基質(zhì)濕度為5%～10%，在孵化箱2 cm處插入水銀溫度計(jì)，以此水銀溫度計(jì)為準(zhǔn)控溫。7 d后檢查，將未受精卵剔除。1.4 組織學(xué)分析

孵化稚龜，暫養(yǎng)1周，解剖取性腺，用Bouin’s液固定，石蠟包埋，切片厚度5 μm，蘇木精-伊紅染色，光鏡（MOTIC BA310-T）下觀察性腺發(fā)育狀況，并拍照。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

數(shù)據(jù)利用Excel 2003和SPSS 16.0軟件進(jìn)行處理，均以X±S表示。單因素方差分析（ANOVA）檢驗(yàn)AI對(duì)孵化期的影響；卡方（χ2）檢驗(yàn)AI對(duì)孵化率和雄性率的影響。

2 結(jié)果與分析

2.1 AI對(duì)中華條頸龜孵化率和孵化期的影響

由表1可以看出，95%乙醇與去離子水對(duì)照組的孵化率和孵化期均無(wú)差異顯著性（χ2=0.02，df=1，P>0.05），95%乙醇溶液作為助溶劑不會(huì)影響胚胎發(fā)育。各處理組孵化率與對(duì)照組無(wú)顯著差異（χ2=1.20，df=1，P>0.05；χ2=1.11，df=1，P>0.05；χ2=0.46，df=1，P>0.05），各處理組孵化期差異不顯著。結(jié)果表明，在一定濃度范圍內(nèi)，AI不會(huì)影響中華條頸龜胚胎發(fā)育速度和孵化率。

2.2 AI對(duì)中華條頸龜性腺分化的影響

由表2可以可知，去離子水和95%乙醇組均有雌性、雄性和間性個(gè)體，整體比較沒(méi)有差異顯著性（χ2=5.04，df=2，P>0.05），雄性率分別為13.64%和14.81%，差異不顯著（P>0.05）；雌性率分別為63.64%和59.26%，間性率分別為22.72%和25.93%，差異不顯著（P>0.05）。 結(jié)果表明， 在30 ℃下孵化，中華條頸龜主要產(chǎn)雌性個(gè)體，乙醇溶液對(duì)性別分化沒(méi)有影響。AI處理組雄性率均顯著高于對(duì)照組（P<0.01），且雄性率隨著處理濃度的升高而增加，5 μg/μL AI處理組達(dá)88.89%，20 μg/μL AI處理組最高95.24%，說(shuō)明AI對(duì)中華條頸龜性別逆轉(zhuǎn)雄性化的作用效果顯著。

2.3 AI對(duì)中華條頸龜性腺影響的組織學(xué)變化

去離子水對(duì)照組和95%乙醇組性腺有卵巢、卵睪體（間性）和精巢，雌性個(gè)體卵巢結(jié)構(gòu)典型，卵巢皮層發(fā)達(dá)，皮層內(nèi)可見(jiàn)發(fā)育良好原始卵泡，髓質(zhì)部退化形成卵巢腔（圖1A、B）；AI處理組僅有精巢和卵睪體，精巢的結(jié)構(gòu)典型（圖1C、D、E）：皮層為一薄層呈白膜狀，髓質(zhì)增生，毛細(xì)血管豐富，有眾多不規(guī)則曲細(xì)精管切面，曲細(xì)精管內(nèi)清晰可見(jiàn)精原細(xì)胞和初級(jí)精母細(xì)胞。對(duì)照組和AI處理組均有卵睪體，對(duì)照組卵睪體組織細(xì)胞大小相近，未見(jiàn)明顯的卵泡和曲細(xì)精管分化；AI處理組卵睪體的組織結(jié)構(gòu)（圖1F），皮層和髓質(zhì)分界不明顯，皮層中可見(jiàn)零星卵母細(xì)胞和初級(jí)卵泡，這些卵泡與正常卵巢中卵泡的結(jié)構(gòu)相似，但大小和數(shù)目均有所減少；髓質(zhì)部細(xì)胞分裂旺盛，大小相近，密集排列呈束，曲細(xì)精管的結(jié)構(gòu)較正常睪丸內(nèi)曲細(xì)精管少，分布較為分散，發(fā)育不完善。

3 小結(jié)與討論

AI主要通過(guò)抑制或降低芳香化酶活性，阻礙類固醇激素的正常代謝途徑，使類固醇激素的生成量發(fā)生變化，從而影響脊椎動(dòng)物正常性別分化和性腺發(fā)育，使雄性率增加，或使雌性動(dòng)物轉(zhuǎn)變成雄性。Crews[7]和Richard-Mercier等[8]用芳化酶抑制劑阻止雌二醇的合成可以引起正在發(fā)育的胚胎發(fā)育為雄性，而不發(fā)育為雌性，認(rèn)為該作用只發(fā)生在基準(zhǔn)溫度下。不同孵化溫度條件下，TSP時(shí)期性腺芳香化酶的活性不同，在25 ℃（產(chǎn)生全雄的溫度）精巢的分化中，芳香化酶活性很低，在30 ℃（產(chǎn)生全雌的溫度）卵巢的分化中，芳香化酶活性達(dá)到最高[16]。據(jù)容銀燕等[15]研究報(bào)道，29 ℃條件下孵化中華條頸龜卵，雄性率為13.6%，31 ℃時(shí)雄性率為4.2%。本試驗(yàn)在產(chǎn)雌的溫度（30 ℃）下孵化，AI也可誘導(dǎo)性腺發(fā)育為雄性，雄性率達(dá)到90%。說(shuō)明利用芳香化酶抑制劑Letrozole處理龜胚，可以通過(guò)抑制龜胚性腺中芳香化酶活性，抑制雌激素的合成，進(jìn)而促使雄性生殖細(xì)胞增殖，完成性別轉(zhuǎn)化過(guò)程。

在提高雄性率的同時(shí)不影響孵化率，孵化率仍達(dá)到90%以上。說(shuō)明在龜類養(yǎng)殖中可利用AI控制龜類性別，滿足生產(chǎn)需求，提高經(jīng)濟(jì)效益，預(yù)示芳香化酶抑制劑在生產(chǎn)實(shí)踐中具有廣闊的發(fā)展前景。

參考文獻(xiàn)：

[1] BULL J J.Sex determination in reptile[J]. Quart Rev Biol， 1980，55：3-21.

[2] 龔世平，史海濤，徐汝梅.龜類溫度依賴型性別決定的保護(hù)生物學(xué)意義[J]. 生物學(xué)通報(bào)，2005，40（3）：8-9.

[3] 楊 超，聶劉旺.兩棲爬行動(dòng)物性別決定的研究進(jìn)展[J].安徽師范大學(xué)學(xué)報(bào)，2003，26（2）：169-172.

[4] 李 珊.孵化溫度對(duì)烏龜性別分化影響的研究[D].長(zhǎng)沙：湖南師范大學(xué)，2003.

[5] 朱新平，陳永樂(lè)，魏成清，等. 溫度對(duì)黃喉擬水龜性別決定的影響[J].生態(tài)學(xué)報(bào)，2006，26（2）：620-625.

[6] 杜衛(wèi)國(guó)，孫寶珺.爬行動(dòng)物溫度決定性別的現(xiàn)象與機(jī)制[J].生物學(xué)通報(bào)，2012，47（3）：1-4.

[7] CREWS D.Temperature-dependent sex determination： The inter-play of steroid hormone and temperature[J]. Zoological Science，1996，13：1-13.

[8] RICHARD-MERCIER N， DORIZZI M， DESVAGES G. Endocrine sexreversal of gonads by the aromatase inhibitor Letrozole in turtle with temperature-dependent sex determination[J].Gen Comp Endocrinol， 1995， 100：314-326.

[9] 楊 巍，張才喬，喬惠理，等.抑制芳香化酶活性對(duì)母雞性腺分化和性行為的影響[J].中國(guó)獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2003，23（4）：390-393.

[10] 王利紅，顧月琴，張 偉.芳香化酶抑制劑誘導(dǎo)番鴨性別的初步研究[J].中國(guó)家禽學(xué)報(bào)，2005，9（1）：68-70.

[11] 顧月琴.芳香化酶抑制劑Formestane和Letrozole誘導(dǎo)番鴨性別分化的研究[D].南京：南京農(nóng)業(yè)大學(xué)，2006.

[12] 李廣麗，劉曉春，林浩然.芳香化酶抑制劑letrozole對(duì)赤點(diǎn)石斑魚(yú)性逆轉(zhuǎn)的作用[J].生理學(xué)報(bào)，2005，57（4）：473-479.

[13] 李延伸.芳香化酶抑制劑對(duì)暗紋東方鲀（Takifugu obscurus）仔稚魚(yú)發(fā)育及CYP19A基因表達(dá)的影響[D].上海：華東師范大學(xué)，2011.

[14] 汪 松，解 焱.中國(guó)物種紅色名錄（第一卷）——紅色名錄[M].北京：高等教育出版社，2004.

[15] 容銀燕，凌 蘭，傅麗容，等.孵化溫度對(duì)中華條頸龜孵化和性別的影響[J].水產(chǎn)科學(xué)，2014，33（4）：191-195.

[16] PIEAU C.Sexual differentiation of gonads as a function of temperature in the turtle Emys orbicularis：Endocrine function，intersexuality and growth[J]. J Exp Zool，1998，281： 400-408.