正交試驗對荷葉總多酚提取工藝的優化

摘要： 研究利用乙醇提取荷葉中的總多酚，探索乙醇體積分數、提取溫度、提取時間、提取pH、提取次數以及料液比對荷葉總多酚提取率的影響，并在單因素試驗的基礎上進行正交優化，最終確定其優化提取條件為乙醇體積分數75%，提取溫度75 ℃，提取時間100 min，提取pH為5，提取2次，料液比為1∶40（g∶mL）。在此條件下，荷葉總多酚的提取率可達2.842%。

關鍵詞：荷葉；總多酚；乙醇；正交試驗

中圖分類號：R284.2 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2015）06-1452-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.06.043

Abstract： The extraction of total polyphenol from lotus leaves by water bath heating method was optimized with single factor and orthogonal experiment. Variables including levels of alcohol， temperature， extraction duration， pH， times and material-solvent ratio were identified by a first set of single factor experiments. The optimal conditions were 75% alcohol， 75 ℃， 100 min， pH 5， extracting twice， and material-solvent ratio 1∶40（W/V）. Under these conditions， the extraction rate of polyphenol from lotus leaf reached 2.842%.

Key words： lotus leaf； total polyphenols； ethanol； orthogonal design

多酚是指廣泛存在于植物體內的多羥基酚類化合物的總稱，在植物體的葉片、果實、皮和根中含量較高[1，2]。多酚類物質除具有生物抗氧化性、抗衰老功能外，還可以降血脂、清暑利濕、促進腸胃消化、增強人體免疫力、抑制細菌與癌細胞生長等作用，可廣泛用于醫藥、保健、食品、化工等領域[3-6]。隨著天然產物開發的逐漸興起，植物多酚成為當前研究的熱點，目前關于茶葉[7]、葡萄皮[8]等植物多酚的提取與功能研究有較多的報道。蓮（Nelumbo nucifera）屬睡蓮科蓮屬，是一種重要的經濟作物，在中國大量種植，其葉片多酚含量較高，但蓮藕采收后荷葉多被廢棄[9]。本研究通過單因素試驗和正交試驗對荷葉總多酚提取工藝進行了優化，以期獲得較好的工藝條件，為更好地促進蓮資源的開發利用提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

荷葉（武植2號）采自湖北省孝感市；福林酚（上海荔達生物科技有限公司）、沒食子酸（天津市紅巖化學試劑廠）、Na2CO3等試劑均為分析純。

101A-3型干燥箱（上海市實驗儀器總廠）；FW135型中草藥粉碎機（天津市泰斯儀器有限公司）；HHS21-6型電熱恒溫水浴鍋（北京長安科學儀器廠）；DL-5-B型離心機（上海安亭科技儀器廠）；HSZ-IID型循環水真空泵（上海亞榮生化儀器廠）；RE-52CS型旋轉蒸發器（上海亞榮生化儀器廠）；722S型可見分光光度計（上海儀電分析儀器有限公司）。

1.2 試驗方法

1.2.1 檢測波長的確定 精確吸取100 mg/L的標準沒食子酸溶液0.2 mL加入1 mL的福林酚試劑，搖勻，靜置5 min，加入10%碳酸鈉溶液，然后用去離子水定容至10 mL，在室溫下避光放置2 h，在分光光度計下進行500～900 nm的全波長掃描，確定最大吸收波長。

1.2.2 標準曲線的繪制 精確吸取30、60、90、120、150 μg/mL的沒食子酸1 mL于10 mL試管中，分別加入3 mL福林酚試劑，搖勻，靜置5 min，加入10%碳酸鈉溶液，搖勻，室溫避光放置2 h，用60%的乙醇定容至10 mL，以空白為對照在最大波長處測定吸光度。以吸光度為縱坐標，沒食子酸濃度為橫坐標，得到標準曲線，其回歸方程為Y=0.045 5X+0.066（R2=0.995 6）。

1.2.3 工藝流程 新鮮荷葉洗凈瀝干→60 ℃烘干→過60目篩→準確稱取荷葉干粉1 g，加入一定體積和體積分數的乙醇溶液，調pH→恒溫水浴，重復提取→離心（5 000 r/min離心20 min） →收集上清液→濃縮。

1.2.4 單因素試驗 分別考察乙醇體積分數（30%、45%、60%、75%、90%）、提取溫度（30、45、60、75、90 ℃）、pH（3.5、4.0、4.5、5.0、5.5）、提取時間（20、40、60、80、100 min）、料液比（g∶mL，下同）（1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50）、提取次數（1、2、3、4）等因素對提取效果的影響。

1.2.5 正交試驗 根據單因素試驗結果，以乙醇體積分數、提取溫度、提取時間、提取次數為因素，進行4因素3水平正交試驗，優化提取工藝。

1.2.6 總多酚含量的測定 準確稱取荷葉干粉1 g放入250 mL的三角瓶中，按方案提取后定容至100 mL。然后按“1.2.2”的方法測定吸光度，重復測定3次，取平均值計算總多酚的含量，并計算總多酚提取率。

總多酚提取率=總多酚的含量/荷葉粉的質量×100%

所有數據均用DPS v 7.05版軟件進行處理。

2 結果與分析

2.1 最大吸收波長的確定

在500～900 nm波長掃描同一濃度的沒食子酸標準溶液，得到沒食子酸溶液的吸收光譜在768.5 nm處有最大吸收峰，所以選定768.5 nm為最大吸收波長。

2.2 單因素試驗結果

2.2.1 乙醇體積分數對荷葉總多酚吸光度的影響

由表1可知，乙醇體積分數對荷葉總多酚的提取有顯著影響。在一定范圍內隨著乙醇體積分數的增加，荷葉總多酚的吸光度增加明顯，但是當乙醇的體積分數達到75%以后，繼續增加乙醇體積分數，荷葉總多酚的吸光度有所下降。所以在正交試驗中，乙醇體積分數選擇75%左右為宜。

2.2.2 提取溫度對荷葉總多酚吸光度的影響 由表2可知，提取溫度對荷葉總多酚吸光度影響很大。在一定的范圍內，隨著提取溫度的升高，荷葉總多酚吸光度的增加明顯，尤其是當溫度從60 ℃上升到75 ℃的時候，同一個溫度梯度吸光度增加的最多。當溫度超過75 ℃的時候，再增加溫度荷葉總多酚的吸光度反而有所下降。

2.2.3 pH對荷葉總多酚吸光度的影響 由表3可知，pH對荷葉總多酚的提取有較大的影響。在設定的pH范圍內，隨著pH的增加，吸光度也逐漸增加，當pH為5.0時，吸光度達到最大，進一步增加pH，荷葉總多酚吸光度反而有所下降。

2.2.4 提取時間對荷葉總多酚吸光度的影響 由表4可知，提取時間對荷葉總多酚吸光度的提取有著顯著地影響。在設置的時間范圍內，隨著時間的增加，溶劑與荷葉粉作用的時間變長，吸光度增加，當作用時間達到100 min時吸光度最大。

2.2.5 料液比對荷葉總多酚吸光度的影響 由表5可知，料液比對荷葉總多酚的提取有著顯著的影響。隨著溶劑量的加大，荷葉總多酚的吸光度顯著增加，但是較其他因素來看，吸光度增加的幅度不大。當料液比為1∶40時，溶液吸光度達到最大，繼續增加溶劑的體積，總多酚的吸光度反而有所下降。

2.2.6 提取次數對荷葉總多酚吸光度的影響 由表6可知，提取次數對荷葉總多酚的影響顯著。在設置的提取次數范圍內，隨著提取次數的增加，吸光度顯著增加，提取3次和提取4次，吸光度無顯著差異。為了不造成資源的浪費和節約成本，選取提取次數以不超過3次為宜。

2.3 正交試驗結果

從上述單因素的結果可以看出，乙醇體積分數、提取溫度、提取時間、提取次數對荷葉總多酚的提取影響更大，考慮到因素之間可能存在有交互作用，因此在pH為5.0、料液比為1∶40的條件下，選取這4個因素按照L9（34）正交設計進行正交試驗。以荷葉總多酚提取率為指標，因素與水平見表7，正交試驗結果見表8。

由表8中的k值分析得到最佳組合為A2B2C3D2，即乙醇體積分數為75%、提取溫度為75 ℃、提取時間為100 min、提取2次。由極差分析可知，各因素對荷葉總多酚提取率影響的大小依次為提取次數、提取時間、乙醇體積分數、提取溫度。

由于正交試驗優化得到的最佳組合與表8中提取率最高的試驗組合不一致，所以需要進行對比驗證試驗，試驗重復3次。在組合A2B2C3D2的條件下，荷葉總多酚的平均提取率為2.842%，比試驗組合A3B1C3D2的提取效果更好，且其相對偏差RSD為0.000 6<0.01。因此，通過正交試驗優化的最佳工藝條件合理，提取率高且具有良好的穩定性。

3 小結

本研究通過單因素試驗探索了乙醇體積分數、提取溫度、提取時間、提取次數、pH以及料液比對荷葉總多酚提取率的影響。結果表明，乙醇體積分數、提取溫度、提取時間、提取次數對荷葉總多酚提取率的影響相比其他兩個因素更為顯著。

正交試驗結果表明，提取溫度、提取時間、提取次數、乙醇體積分數4個因素對荷葉總多酚提取率均有極顯著影響，其影響程度依次為提取次數>提取時間>乙醇體積分數>提取溫度；優化得到最佳提取工藝條件為乙醇體積分數75%、提取溫度75 ℃、提取時間100 min、提取2次，在此試驗條件下，荷葉總多酚的提取率為2.842%，達到了較高的提取水平。

參考文獻：

[1] 左 玉.多酚類化合物研究進展[J].糧食與油脂，2013，26（4）：6-10.

[2] 龐道睿，劉 凡，廖森泰，等.植物源多酚類化合物活性研究進展及其應用[J].廣東農業科學，2013（4）：91-94.

[3] 鄧國棟，莊大海.荷葉黃酮類化合物提取工藝研究[J].山地農業生物學報，2010，29（5）：428-431.

[4] 唐裕芳，張妙玲，劉忠義，等.荷葉研究現狀與展望[J].食品研究與開發，2004（4）：14-16.

[5] 周蘭香，黃阿根，謝凱舟，等.分光光度法與HPLC法測定荷葉總黃酮的研究[J].中草藥，2002（1）：35-37.

[6] 陳海光，余以剛，曾慶孝.荷葉功能成分的提取研究[J].食品與機械，2001（5）：16-17.

[7] 浦周芳，韓麗琴，曹宏梅.茶葉中茶多酚提取及含量測定的研究[J].食品研究與開發，2013，34（17）：83-85.

[8] 王 穎，王國紅，鄧紅梅，等.葡萄皮中多酚類化合物提取工藝的優化[J].湖北農業科學，2013，52（15）：3622-3627.

[9] 中國科學院武漢植物研究所.中國蓮[M].北京：科學出版社， 1987.