PRRSV—R98在激流灌注式生物反應矗內增殖水平的研究

摘要：為了建立激流灌注式生物反應器規模化生產豬繁殖與呼吸綜合征活疫苗的生產工藝，本研究以AP20C型生物反應器為生產工具對豬繁殖與呼吸綜合征病毒R98株（PRRSV-R98）的增殖水平進行了研究。結果顯示，應用激流灌注式生物反應器生產豬繁殖與呼吸綜合征病毒96h達到最佳接毒時間，接種后36～39h收獲病毒液，效價較轉瓶提高十倍以上。

關鍵詞：Marc-145細胞；PRRSV-R98；激流灌注式生物反應器

在豬的多種疾病中豬繁殖與呼吸綜合征（Porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS）是危害全球養豬業最為嚴重的傳染病之一。防治PRRS的最有效方法是使用疫苗進行免疫預防，因此，優質高效的病毒液是疫苗生產中非常重要的一個環節圜。

目前，商品化的豬繁殖與呼吸綜合征病毒疫苗主要是通過傳統的轉瓶工藝生產。我公司應用生物反應器進行豬繁殖與呼吸綜合征病毒R98株的批生產研究，取得較好效果。現將研究結果報告如下。

1 實驗材料

1.1 細胞

Marc-145細胞由瑞普（保定）生物藥業有限公司研發部保存、提供。

1.2 毒種

PRRSV-R98由瑞普（保定）生物藥業有限公司種毒室保存、提供，效價107.3TCID50/mL。

1.3 主要設備

AP20C型激流灌注式生物反應器，購自杭州安普生物工程有限公司。

1.4 主要試劑及生產廠家

高糖DMEM培養基、胰蛋白酶出自GIBCO，新生牛血清出自蘭州民海生物工程有限公司。

2 實驗方法

2.1 激流灌注式生物反應器前期準備及安裝

按照說明書檢驗系統氣密性，PBS平衡系統。校準pH電極、溫度電極，極化溶氧電極，121℃高壓30min備用。連接管道、呼吸袋，安裝電極。

2.2 反應器細胞接種及培養

取長成良好單層的10L轉瓶細胞7個進行消化，制備種子液6L，采用兩步法接種接種至生物反應器。

設置設備參數如下：T1：37℃，T2：39.5℃，T3：36.5℃，pH： 7.3，D0：50%，震蕩速度45r/m，循環速度250mL/min，啟動細胞培養程序，進行細胞培養，每12h取樣測殘糖量，計算耗糖量，及時補充營養液，逐漸增大循環速度。

2.3 PRRSV-R98在生物反應器中的接種及培養

通過檢測反應器內細胞耗糖量確定細胞生長狀況，當糖耗量趨于平穩且達到最大值時，接種PRRSV-R98懸液200mL并更換含2% FBS的細胞維持液。對病毒增殖過程的42h進行監測，每6h取樣測殘糖，接種后18h開始每3h取樣，測定培養液中的病毒滴度。 依此方法，連續完成04批、05批和06批3個批次生物反應器的病毒培養。分析病毒增殖規律，觀察病毒峰值出現的時間，從而準確把握最佳病毒收獲時間。

3 實驗結果

3.1 細胞接種培養

制備的細胞懸液中含細胞總數約2.3×109個，檢測04、05和06三個批次的耗糖可知反應器內細胞96h以后細胞耗糖趨于穩定，細胞數達到最大，達到最佳接毒時間。耗糖量變化（如圖1）。

3.2 PRRSV-R98在生物反應器中的接種及培養

反應器內細胞接種PRRSV-R98后耗糖量變化與時間關系（如圖2）。

反應器內細胞接種PRRSV-R98病毒后耗糖高峰出現在30h前后，約為3.0～3.2g/L/24h。

生物反應器培養體系培養PRRSV-R98病毒滴度與時間變化關系（如圖3）。

應用生物反應器培養PRRSV-R98病毒產毒高峰出現在36～39h，約為108.3-8.7TCID50/mL。故最佳收獲時間為接毒后36～39h。

4 討論

應用激流灌注式生物反應器培養Marc-145細胞生產豬繁殖與呼吸綜合征病毒既能實現細胞高密度生長，而且自動化水平較高，生產過程穩定可控，降低了產品批間差異，從而大大提高了病毒抗原的產品質量。

值得注意的是，激流灌注式生物反應器生產工藝的收獲時間是根據廠家給出的經驗值和實時糖耗水平來確定。本研究中，培養體系中耗糖高峰出現在30h前后，而其病毒滴度高峰出現在接毒后36～39h，如果我們根據耗糖結果來確定收獲時間將會直接導致病毒滴度不高。其原因可能是灌注袋內細胞數量很大，接種病毒后細胞大量產毒致使耗糖量急劇增加，產生耗糖高峰；而此時細胞尚未破碎，隨時間的延長，大量細胞的病變、死亡將病毒釋放到培養液中達到一個峰值，使得此時培養液中病毒滴度最高。

研究還發現，灌注袋反復凍融后的病毒懸液效價較激流袋病毒液效價高出近10倍。可能是因為灌注袋中細胞數量很大，里層的細胞與外周培養液中的物質交換較慢，細胞代謝水平、細胞的病毒感染和病毒增殖速度都較外層載體上的細胞低。如果上述理論成立，我們可以在效價高峰收獲病毒液后再向反應器中注入新鮮維持液繼續培養，或者采用其他收獲方式，如流加收獲，充分利用所有的細胞，將有可能大幅度提高病毒產量。