新型稀釋液TCM199和甘油對牛精液凍存效果研究

摘要：通過對以TCM199為主要稀釋劑，以甘油（GL）為冷凍保護劑的牛細管凍精的活力測定，篩選出了以TCM199、GL為稀釋劑和冷凍保護劑的新型牛細管凍精制作配方。測定表明，以TCM199為主要稀釋劑、GL為冷凍保護劑時，配方11的活力最高，達到0.60。

關鍵詞：TCM199；甘油；細管凍精；活力

1 試驗目的和要求

近年來的研究表明，在細胞、胚胎冷凍過程中，為了克服低溫對胚胎等微小生命的打擊，減少或消除細胞和組織間冰晶的形成，必須在培養液中添加一定量的抗凍劑。以前使用的主要是二甲基亞砜（DMSO）或甘油（GL），但是他們均對細胞或胚胎產生了一定的毒副作用，其中DMSO的毒性比GL強，所以現多用GL。本試驗將利用TCM199作為能量和營養素來源，以GL作為冷凍保護劑，多梯度研究TCM199、GL作為稀釋劑和冷凍保護劑保護精子的最優劑量，建立新型牛精液稀釋和冷凍保存技術。

2 試驗設備和要求

種公牛來自寧縣興旺牧業種牛場和甘肅省畜牧獸醫研究所牛場。主要設備有人工采精器械、專用保溫箱、吸管、冰箱、冷凍儀等。

3 試驗方法和步驟

稀釋液：按照設計配方、用量進行配制。

冷凍液：第一液為低濃度冷凍液，用于牛精液采集后的第一次稀釋；第二液為高濃度冷凍液，用于第二次平衡稀釋。

TCM199按照其說明濃度配制，并用酚紅和NaOH進行pH標定。GL按照設計添加。

本試驗針對以下3種處理實施，即測定不含冷凍保護劑時的精子凍存效果、添加TCM199但不含冷凍保護劑的精子凍存效果、以TCM199和GL為冷凍保護劑時的精子凍存效果。每個水平測定10次（重復），每次制作100枚細管凍精，從中隨即抽檢10枚，每次抽檢測定均在制凍后24h進行。試驗結果用spss統計分析。

4 試驗結果

4.1 不含冷凍保護劑時的精子凍存效果

4.1.1 配方組合本試驗系列配方中設計缺失TCM199、乙二醇（EG）和GL，僅僅用常規能量、抗生素構成稀釋液，并進行冷凍保存和解凍觀測。目的是評定和掌握牛精液的保存和抗冷凍打擊的特性，為下一步試驗提供參考數據。各組合配方詳見表I。

本系列配方中用卵磷脂替代卵黃，添加tris以圖進一步提高稀釋液的緩沖能力，給精子提供良好的生存環境。

4.1.2 不合冷凍保護劑的細管凍精解凍效果按照試驗設計設定的時間，對凍存24h后的試驗凍精進行解凍。解凍時先準備好30℃水浴，將細管凍精在水浴中攪動2～3s解凍，用細管剪剪掉細管兩端封口，分別在安排時段提取該管解凍精液抹片觀察和記錄，觀察溫度為25℃。

每組配方測定10枚細管凍精。解凍效果統計詳見表2。

測定結果表明：

1）在不添加冷凍保護劑和稀釋劑，但添加果糖等基礎營養素的情況下，用超純水稀釋冷凍的牛精液也保持了適度的解凍活力。效果最好的為8號配方，在18h時的活力仍然維持在0.3的水平。

2）在不添加其它成分，僅僅用超純水稀釋的情況下，解凍凍精也有較高的活力，并且維持了較長時間。如10號配方，剛解凍后的活力有0.45，只是有效活力維持時間短。

3）活力衰減速率不一致。圖1是表2資料的圖示效果，各組在0～6h期間的活力下降最快，6～30h期間活力緩慢下降，30～48h期間的活力平穩下降。

4.2 添加TCM199但不含冷凍保護劑的細管凍精解凍效果

本項試驗中，稀釋液僅僅添加了不同劑量的TCM199，未添加GL和EG，以便更好地掌握TCM199在牛精液冷凍保存過程中的效果。各組配方和效果測定分述如下。

4.2.1 配方組合添加TCM199但不含冷凍保護劑組的配方詳見表3。在測定不同濃度TCM199的同時，在平行配方中還添加了Tris、檸檬酸鈉、卵磷脂等。其中1、2、3、4、7號添加了Tris，5、6、8號添加了檸檬酸鈉，9號添加了卵磷脂。

4.2.2 細管凍精解凍效果添加TCM199但不含冷凍保護劑組的解凍效果詳見表4。

測定結果表明：

1）在只添加TCM199而未添加冷凍保護劑的情況下，冷凍解凍精液也保持了一定的活力。效果最好的為1號和5號配方，在18h時的活力仍然維持在0.2～0.3的水平。其它各組合在剛解凍時活力還較高，但持續時間短，活力下降速度快。

2）活力下降高峰期出現在0～6h階段。各組下降速度基本一致，在圖2中顯示出相似的斜率。在6～24h階段，各組合活力的下降速度趨緩，但在24～30h階段又出現了活力迅速下降的現象，此后精子開始顯著衰竭、殘缺和死亡，失去了受精能力。

4.3 以TCM199和GL為稀釋劑和冷凍保護劑時的精子凍存效果

4.3.1 配方組合

表5中2項試驗對不添加TCM199、GL、EG以及不添加GL或EG的稀釋液、冷凍液對牛精液的冷凍保存和解凍活力進行了探討，初步掌握了在這2種情況下牛精液的保存情況，從本項試驗開始，將在此基礎上，對添加冷凍劑的情況進行深入研究。本項將測定以TCM199和GL為冷凍保護劑時的精子凍存效果。其系列配方詳見表5。特點是TCM199梯度增加，GL適度變化，5號配方增加了安鈉加。

測定結果表明：

1）不同濃度TCM199+GL組的凍精解凍活力不同。0～12h活力11、2、3號組高于其它組（p<0.01），同時，1、4、10號也表現出了較高的活力。

2）活力衰減速率不一致。如圖2所示。活力衰減比較緩慢的是1、2、3、4、11號，減緩比較快的是5、6、7、8、9、10號。從配方構成看，衰減緩慢的組中TCM199和GL的比例低，衰減快的含量高且添加了檸檬酸鈉。11號中TCM199和GL的比例雖然高，但卻表現出了本專題試驗中最好的曲線，這與缺失果糖和檸檬酸鈉有關。

3）綜合比較。TCM199本身就是一種復合型營養體，含有細胞生長發育的多種營養成分。添加過多的其它營養物質反而未得到更高的活力表達，如無其它營養素的11號最好，添加了檸檬酸鈉和果糖的最差，未添加檸檬酸鈉的較好，這在圖3中給予了直觀反映。

5 結果與分析

通過本次對TCM199、GL組及其對比試驗表明：

1）未添加試驗成分的牛精液的冷凍解凍效果。本試驗的基礎液為果糖和超純水，部分組合中添加了檸檬酸鈉、tris或卵磷脂，但未添加GL。其冷凍精液解凍后也表現出了一定的活力，特別是剛解凍后的活力比較高，但在解凍后活力迅速下降，畸形精子迅速增多，可判斷為該類精子的受精能力低下，不能用于生產性配種繁育。同時也說明牛精液自身具備良好的抗低溫打擊能力。

2）以TCM199為主的牛精液冷凍解凍效果。本試驗是在基礎液果糖和超純水的基礎上，加入了TCM199，同時也在部分組合中添加了檸檬酸鈉、tris或卵磷脂，但未添加GL。其冷凍精液解凍后的表現與未添加TCM199和GL的組相似，也表現出了一定的活力，特別是剛解凍后的活力比較高，但在解凍后活力迅速下降，隨著時間延長，畸形精子不斷增多。效果最好的為l號和5號配方，在18h時的活力仍然維持在0.2～0.3的水平。

3）以TCM199+GL為主的牛精液冷凍解凍效果。本試驗是在基礎液果糖和超純水的基礎上，加入了TCM199和GL，同時也在部分組合中添加了檸檬酸鈉、tris或卵磷脂。其冷凍精液解凍活力明顯高于未添加TCM199和GL的組和僅添加TCM199的組。測定表明，不同濃度TCM199+GL組的凍精解凍活力不同。活力高且比較穩定的是11、2、3號組

4）綜合分析。通過對3種不同處理及其多樣本資源的測定與分析，表明牛精液的處理方法不同，其凍精解凍活力不同。空白處理和僅添加TCM199的處理測定說明了精子本身具有良好的抗低溫打擊能力，解凍活力較好，但維持時間很短，活力喪失速度快，精子品種不佳，不具備受精能力。TCM199+GL組解凍凍精的質量較高，其解凍精子的活力維持時間較長，精子品質較高。推薦配方為TCM199+GL組的配方11。