ELISA法乙肝兩對半檢測的影響因素觀察

乙肝兩對半是診斷、治療乙肝的有效指標，臨床醫學檢驗中常應用酶聯免疫吸附法（ELISA）檢測乙肝兩對半，該法穩定、靈敏度高、易操作、特異性強、重復性好。在ELISA實際檢驗過程中常會受到多種因素的影響，造成實驗結果與事實存在一定的誤差。本文現探討ELISA法檢測乙肝兩對半的影響因素和臨床意義，詳情報道如下。

1檢測前的影響因素

1.1標本的影響

1.1.1標本采集

紅細胞破裂釋放的過氧化物酶等物質可能干擾實驗結果，造成假陽性或假陰性，因此在采集標本時應盡量避免溶血；抗凝不完全也可因纖維蛋白原干擾出現假陽性，因此檢測過程盡量不采用抗凝血，尤其避免使用肝素抗凝的血液標本；標本中含有細菌、支原體、衣原體等微生物同樣會對實驗結果產生干擾；試驗過程中使用一次性非抗凝真空試管，避免試管等器械的交叉使用，避免因交叉污染造成結果出現假陽性。另外部分血液樣本中存在的類風濕因子、脂濁、黃疸及甲胎蛋白等因素也會對實驗結果產生影響。

1.1.2標本保存

標本可在-20℃存放1年，使用前解凍，室溫平衡30min，但反復凍融次數不宜不超過3次。另外儲存于2～8℃的標本，存放時間超過1周也可能影響結果。

1.2試劑盒影響

1.2.1試劑盒的選擇

ELISA試劑盒應選擇國家有關部門檢定合格的產品，目前，國內ELISA試劑盒的質量參差不齊，進口試劑盒質量相對較好，實驗室應選擇準確度好、靈敏度高和重復性好的試劑盒，以保障試驗結果的準確度。

1.2.2試劑盒的保存

ELISA試劑盒儲存于2～8℃，并作好實驗室儲藏記錄。試劑盒使用前于室溫平衡30min，以保證實驗結果的準確性。

1.3檢驗人員的影響

檢驗醫師需定期進行相關培訓，了解酶聯免疫吸附試驗的實驗原理和操作要點。掌握酶聯免疫吸附試驗用于乙肝兩對半測定的質控方法原理及失控處理原則。熟悉試劑盒性能，熟悉操作儀器及正確的操作方法。了解乙肝兩對半標志物之間存在意義。

1.4質控方法的選擇

ELISA法檢測乙肝兩對半定性檢測法質量高低意義在于是否能夠檢出病原體或抗體。室內質控對于乙肝兩對半定性實驗的靈敏性和特異性具有重要意義，因此尋求合適的室內質控方法是保證實驗結果準確的關鍵。我們應用Levey-Jerminings質控圖法和即刻法室內質控法于酶聯免疫吸附試驗仍有不足，實驗過程中受到HOOK effeCT的影響，隨待測物濃度增加，抗原抗體結合物濃度也會增加，然而OD值會在升高至一定程度后開始下降，上述質控方法無法很好的顯示出來。實驗過程中應對失控標本重復檢驗，對灰區結果重復檢驗，登記后報告，提高檢驗準確率。積極主動參加上級部門組織的室間質評工作，找出差距及時糾正，提高實驗室的工作效率和準確性。

2檢驗過程的影響因素

2.1加樣

吸嘴的清潔程度和吸量的準確性會直接影響到檢驗結果的準確度，因此，加樣過程中檢驗醫師應嚴格遵守操作規程，吸頭是一次性使用，向反應孔加標本時應將吸頭尖觸及到反應孔側壁下1/3處，注意避免污染其他反應孔。放到溫育箱前，所加樣需在振蕩器上震蕩30s以上使充分混勻。

2.2溫育

溫育是ELISA法中至關重要的一步，不同的溫育環境對檢測結果會產生一定影響，因此應嚴格按照說明書進行操作，嚴格控制溫育時間和溫度。標本加入板孔中后一出現邊緣效應，多數情況下最貼近孔壁的一層溶液中的待測成分會直接反應，因而室溫下反應很慢，須在37℃環境中擴散至平衡。干育時會產生周邊效應，應反應板周邊孔與中間孔之間存在溫度差異，這樣升溫速率差會直接影響到結果的準確性。因此實驗操作中應使用水育保障整板溫度的快速平衡，減少邊緣效應帶來的誤差。同時注意溫育時貼密封膜，謹防污染。

2.3洗板

洗板可分離結合與未結合抗原抗體復合物及酶標記物，同時去除非特異性吸附蛋白質等干擾物質。洗板使用的洗滌液一般為中性緩沖溶液，含一定的非離子型洗滌劑。洗板時須將反應孔底部保持平整，確保每次放液加滿、吸液吸凈。洗板時均應使用新鮮制造的去離子水稀釋洗滌劑，避免因洗滌劑受污染而影響洗板的效果。洗凈后選擇潔凈的吸水紙進行拍干，防止污染。手工洗板注意避免孔內洗滌液外溢，嚴格控制鄰孔互相造成的污染。

2.4顯色及結果判斷

顯色是最后一步溫育反應，反應的溫度和時間均會影響結果，一般底物載7℃顯色10～40min完成反應，顯色時間不宜過短，避免因一些低滴度可能未能及時出現反應而造成假陰性結果。規定時間內，陽性孔顏色隨時間加長逐漸加深，陰性孔無變化。操作時，A、B液按照順序加入，且間隔不超過10min，染色劑使用不宜過多，反應在暗室或避光環境中進行。反應結果應在規定時間內進行，一般為加入終止液10min內完成，同時避免強光下操作，避免孔內結晶影響酶標儀測試。加終止液時避免出現氣泡使OD值過高，造成假陽性結果。如果顯色但酶標儀讀值為陰性的灰色值樣區的樣本應重復檢驗并使用參比試劑，確證結果。

3其他因素影響

實驗室環境同樣會影響實驗結果，控制實驗室的溫、濕度，濕度控制在35%～65%之間，操作時避免電磁干擾和噪音干擾。

4討論

乙肝是嚴重危害患者身心健康的常見傳染性疾病之一，對患者的生活、學習及工作均有不利影響，因此早期診斷對于患者控制病情具有重要臨床意義。血清兩對半檢測對乙肝的診斷和病情診斷具有重要作用，酶聯免疫吸附法是一種特殊的試劑分析方法，其結果判斷較為客觀，廣泛應用于乙肝、丙肝、梅毒、結核及艾滋等疾病的診斷，但易受實驗室環境、試劑選擇、試劑盒質量、儀器設備、實驗操作掌握熟練程度、顯色及結果判讀等多種因素的影響，如不注意可能導致假陽性或假陰性的結果。因此檢驗醫師應嚴格按照操作規程進行操作，設立陰陽對照及臨界值測定，做好室內質控，對存疑的檢測結果進行重復實驗，避免假陰、假陽性結果，影響病情判斷。