抗精子抗體的測定方法及臨床意義

摘要：目的：分析抗精子抗體的測定方法，推進其醫(yī)學研究進展，在臨床中得到更廣泛地應用。方法：在實驗室環(huán)境下，采用間接法原理的酶促化學發(fā)光免疫分析方法。結論：JETLIA-962型微孔板單光子計數(shù)儀或其他發(fā)光免疫分析儀，包括振蕩器、洗板機、水浴箱，可對抗精子抗體進行精確的測定，使精子質膜顆粒的流動性而阻礙獲能，阻止精子穿過透明帶與卵子的結合，引起受精的失敗，引起不育不孕具有重要意義。

關鍵詞：抗精子抗體；檢驗方法；臨床意義

【中圖分類號】R4 【文獻標識碼】A 【文章編號】1672-8602（2015）03-0110-02

抗精子抗體（ASA）采用間接法原理的酶促化學發(fā)光免疫分析方法。純化的相應抗原物質預先結合在微孔板的表面，加入待測樣本后，樣本中相應的抗體與微孔板表面的抗原特異性結合，洗滌后，形成的免疫復合物與隨后加入的辣根過氧化物酶（HRP）標記的抗人單克隆抗體相結合，這樣在微孔板表面形成了抗原一特異性抗體一酶標記二抗的免疫復合物，洗滌后加入發(fā)光底物，測定相對發(fā)光強度，與同時測定的陰性對照品相比較，確定樣本中是否存在相應抗體。下面將抗精子抗體的測定方法及臨床意義分析匯報如下。

1 檢驗準備

1.1 標本采集

采血方法：采集無抗凝靜脈血2～3ml，也可采集EDTA（1.5g/L全血）、枸櫞酸鈉（10.9mmol/L全血）或肝素（20～30U/ml全血）作抗凝劑的血漿。

標本保存：室溫保存，及時檢測。樣本在15～25℃放置不超過4h；2～8℃保存不超過12h；-20℃或低于～20℃保存不超過2個月，避免反復凍融；復融的凍存樣本應充分平衡至室內溫度后方可用于測定。

1.2 注意事項

推薦選用血清，測定前應平衡至室內溫度。樣本中含有疊氮鈉、微型顆粒物會影響實驗結果，同時應避免使用乳糜血、高蛋白血、低膽紅素血、輕微溶血或生物污染的血液標本。

1.3 試劑

試劑來源：采用北京源德生物醫(yī)學工程有限公司提供配套試劑。

試劑組成：包被板：8×12條（96人份）或8×6條（48人份）；酶結合物2瓶（96人份）或1瓶（48人份）；陽性對照1瓶；陰性對照l瓶；樣本稀釋液1瓶；發(fā)光液A l瓶；發(fā)光液B l瓶；濃縮洗滌劑1瓶。

1.4 試劑準備：試劑應置室溫平衡30min。用蒸餾水將濃縮洗滌液稀釋20倍后使用。液體試劑使用前應充分混勻。

1.5 試劑保存：未開封試劑盒及其各組分在2～8℃可保存至有效期。開封使用后酶結合物、陰性對照、陽性對照、樣本稀釋液、洗滌液可于2～8℃穩(wěn)定4周；包被板、發(fā)光液穩(wěn)定8周。

1.6 儀器：采用JETLIA-962型微孔板單光子計數(shù)儀或其他發(fā)光免疫分析儀，包括振蕩器、洗板機、水浴箱。

2 檢驗步驟

2.1 實驗設計：根據(jù)陰性、陽性對照、質控品及樣本數(shù)量截取微孔板條，在板架上放好微孔板條（陰性對照品至少設3孔，陽性對照品至少設l孔）。

2.2 加樣：在陰性、陽性對照品孔位中分別加入l00μl的陰性、陽性對照。在相應的待測樣本孔位中分別加入lOOμl的樣本稀釋液和lOμl樣本或質控品（建議先加入樣本稀釋液），加入樣本時應吸打混勻（樣本孔會變藍，提示已加樣）。

2.3 溫育：蓋上封板膜，在振蕩器上振蕩片刻（不少于5s），置37℃水浴箱中溫育30min。

2.4 洗板：機洗或手洗。吸出或倒出反應液，加入洗滌液洗5次（每次加入洗液后靜置時間不少于30s），洗滌液量每次每孔不少于300 μl，末次洗板后將板拍干。

2.5 加酶結合物：每孔依次加入lOOμl酶結合物。

2.6 溫育：同步驟2.3。

2.7 洗板：同步驟2.4。

2.8 檢測：用加樣器向每孔中分別加入發(fā)光液A、B液各50μl（共lOOμl），振蕩片刻（不少于5s），避光放置（5±0.5）min，測定相對發(fā)光強度。

2.9 設定孔位信息：在軟件支持下將各孔位按實驗需要進行定義，并按軟件提示輸入相關信息。

3 注意事項

3.1 環(huán)境相對濕度低于60%時，應關注樣本及液體試劑蒸發(fā)濃縮對實驗結果的影響。

3.2 試劑盒應在有效期內使用，不可混用不同批號試劑及過期試劑。使用前試劑需平衡至室溫。樣本和試劑不能長時間于室溫放置，使用后剩余組分應迅速放回2～8℃保存。

3.3 實驗過程中發(fā)光液和酶標記物要避免強光直射。

3.4 試劑和樣本使用前要充分混勻并避免起泡，沿孔壁加樣以避免外濺或產生氣泡。

3.5 孵育及振蕩過程中要避免微孔內水分的蒸發(fā)，應及時蓋上蓋板膜。

3.6 洗板時每次加入洗液量不能太多，以免造成溢液污染。

3.7 加入發(fā)光液后避光放置（5±0.5）min，測定相對發(fā)光強度，測定時的室內溫度應在20～30℃。

4 結果判定

陰性對照品的平均RLU的2.1倍為Cut-Off值。用每個樣本的RLU與Cut-Off值的比值（S/CO）來判斷該樣本為陰性或陽性。S/CO≤1.0的為陰性，>1.0為陽性，配套儀器中的操作軟件可自動完成上述判斷，也可以選擇人工計算。測定正常參考值所用樣本均為-20℃冷凍后復融的血清樣本。各實驗室應建立自己的Cut-Off值，上述Cut-Off值僅供參考。

5 臨床意義

抗精子抗體是由于男性的血睪屏障破壞，或女性的生殖器官的炎癥、損傷造成精子進入血液或淋巴循環(huán)，與免疫系統(tǒng)接觸，引發(fā)免疫應答，產生抗體，無論精液還是宮頸黏液中存在的ASA抗體，接觸精子后都會使其產生運動特征的改變，并影響精子質膜顆粒的流動性而阻礙獲能，阻止精子穿過透明帶與卵子的結合，引起受精的失敗，引起不育不孕。

參考文獻

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