水貂大腸桿菌的分離?鑒定及藥敏試驗

孫蓉蓉　鄒玲　劉文華　張燦　李文立　任慧英

摘要[目的]為更好預(yù)防水貂大腸桿菌病提供依據(jù)。[方法]從山東某大型水貂養(yǎng)殖場采集病料，通過病原分離、培養(yǎng)特性、染色特性和生化試驗等對病原進(jìn)行分離與鑒定，并對分離菌進(jìn)行藥敏試驗。[結(jié)果] 共分離致病菌18株，其中有10株為大腸桿菌，說明該養(yǎng)殖場主要的細(xì)菌病為大腸桿菌感染。藥敏試驗結(jié)果表明分離出的大腸桿菌對大多數(shù)抗菌藥物敏感。[結(jié)論] 水貂發(fā)生細(xì)菌病后，應(yīng)盡可能通過藥敏試驗篩選敏感藥物，避免盲目投藥。

關(guān)鍵詞 水貂；大腸桿菌；分離；鑒定；藥敏試驗

中圖分類號 S852.6 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A 文章編號 0517-6611（2015）11-119-01

水貂大腸桿菌病是水貂的一種腸道傳染病，常呈敗血型經(jīng)過，伴有嚴(yán)重下痢，侵害呼吸器官，死亡率高[1]。自20世紀(jì)80年代以來，山東省水貂養(yǎng)殖場數(shù)量逐年增加。據(jù)海關(guān)貿(mào)易總署統(tǒng)計，全國平均年產(chǎn)水貂皮1 200萬張，其中山東省占2/3。養(yǎng)殖水貂利潤很高，是農(nóng)民脫貧致富的有效途徑，深受農(nóng)民的歡迎[2]。由于養(yǎng)殖水貂的規(guī)模不斷擴(kuò)大，水貂抗病力逐年降低。條件性致病菌是繼發(fā)水貂細(xì)菌病的主要病原，給水貂養(yǎng)殖業(yè)帶來巨大的經(jīng)濟(jì)損失，也制約了水貂養(yǎng)殖業(yè)的進(jìn)一步發(fā)展。

近年來，科研工作者對水貂病毒性疾病的研究較為深入，并且已經(jīng)得到一定控制，而對水貂細(xì)菌性疾病的相關(guān)報道則很少。筆者通過對山東省威海市某大型養(yǎng)殖場的病料采集，分離并鑒定了10株水貂大腸桿菌，并對分離菌株進(jìn)行了藥敏試驗，以期為更好地預(yù)防水貂大腸桿菌病提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 病料來源

病料采自山東省威海市某水貂養(yǎng)殖場新鮮病死水貂。

1.2 主要試劑

普通營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、麥康凱瓊脂、三糖鐵瓊脂（TSI），均購自北京路橋技術(shù)有限公司；大腸桿菌顯色培養(yǎng)基為青島海博生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；葡萄糖蛋白胨水、糖發(fā)酵管、西蒙氏枸櫞酸鹽瓊脂、藥敏紙片均購自杭州天和微生物試劑有限公司。

1.3 細(xì)菌的分離

無菌取病死水貂的肝臟，分別劃線接種于普通營養(yǎng)瓊脂、麥康凱瓊脂培養(yǎng)基，37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h，觀察細(xì)菌生長情況及菌落特征。

1.4 細(xì)菌的純化及形態(tài)觀察

取初步分離的細(xì)菌，劃線接種于麥康凱培養(yǎng)基及大腸桿菌顯色培養(yǎng)基上，37 ℃恒溫純化培養(yǎng)24 h，挑選典型菌落在新鮮斜面上進(jìn)行純培養(yǎng)。挑取1環(huán)細(xì)菌的純培養(yǎng)產(chǎn)物，按照常規(guī)方法進(jìn)行革蘭氏染色鏡檢。

1.5 生化鑒定

1.5.1糖類代謝試驗。 挑取麥康凱培養(yǎng)基上的典型菌落，接種微量糖發(fā)酵管、三糖鐵瓊脂培養(yǎng)基，37 ℃條件下恒溫培養(yǎng)24 h后觀察結(jié)果。

1.5.2 其他生化反應(yīng)。

挑取麥康凱培養(yǎng)基上的典型菌落，按照常規(guī)方法進(jìn)行吲哚試驗、MR試驗、VP試驗及檸檬酸鹽利用試驗（合稱IMViC試驗）[3]。

1.6 紙片擴(kuò)散法藥敏試驗

將濃度為10.8 CFU/ml的新鮮菌液涂布普通營養(yǎng)瓊脂平板，放置5 min后將18種藥敏紙片貼于平板表面，37 ℃條件下培養(yǎng)18 h后觀察結(jié)果，按照CLSL標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行藥物敏感性評價[4]。

2 結(jié)果與分析

2.1 細(xì)菌培養(yǎng)結(jié)果

從28份病料共分離出18株細(xì)菌。分離菌在普通瓊脂培養(yǎng)基上形成圓形隆起、表面光滑、濕潤、邊緣整齊、半透明的灰白色菌落；其中，10株分離菌在麥康凱培養(yǎng)基上形成桃紅色、光滑、中等大小的菌落。在大腸桿菌顯色培養(yǎng)基上形成藍(lán)綠色菌落。

2.2 形態(tài)及生化鑒定

將各分離菌進(jìn)行革蘭氏染色并鏡檢，可見淡紅色、短小的桿狀細(xì)菌。各分離菌均可以分解葡萄糖、乳糖、麥芽糖、甘露醇，產(chǎn)酸產(chǎn)氣，60%的菌株還利用蔗糖；三糖鐵瓊脂培養(yǎng)基上斜面和底層均產(chǎn)酸，變黃，產(chǎn)氣，不產(chǎn)生硫化氫；IMViC試驗結(jié)果為“+ + - -”。根據(jù)《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊》可知，上述分離菌均符合大腸桿菌的特性[5]，因此可以確定其為大腸桿菌。

2.3 藥敏試驗結(jié)果

根據(jù)CLSI標(biāo)準(zhǔn)可知，10株大腸桿菌對不同藥物的藥敏紙片的抑菌情況如表1。

從表1可以看出，10株水貂大腸桿菌分離株對18種抗生素均有不同程度耐藥，其中環(huán)丙沙星、諾氟沙星、鏈霉素、四環(huán)素、氨芐西林5種抗菌藥的耐藥性都大于50%，而對頭孢哌酮、頭孢他啶、頭孢吡肟的耐藥率為0。10株大腸桿菌分離株對18種抗生素的敏感性也有所不同，以頭孢西叮、頭孢他啶、頭孢吡肟敏感率最高，達(dá)到100%。除1株大腸桿菌僅對四環(huán)素耐藥（1耐）外，其他均為多耐菌株，其中2個2耐菌株，1個3耐菌株，1個4耐菌株，2個7耐菌株，1個9耐菌株，2個菌株同時對13種抗菌藥物表現(xiàn)為耐藥。

3 討論

筆者對某大型養(yǎng)貂場進(jìn)行了為期3個月的病料采集，共收集28次（份）病料，經(jīng)實驗室分離與鑒定，共獲得10株大腸桿菌，分離率為35.7%，說明大腸桿菌是該養(yǎng)貂場的主要細(xì)菌病原，這與文獻(xiàn)中的大腸桿菌病是水貂常發(fā)病的報道一致[6-8]。大多數(shù)大腸桿菌是人類和動物腸道中的共棲菌，但當(dāng)細(xì)菌發(fā)生移位，入侵腸外組織，即成為條件性致病菌，另外，還有某些血清型的大腸桿菌是人類和動物的重要致病菌[9]。水貂大腸桿菌病的發(fā)病與飼養(yǎng)場內(nèi)的飼養(yǎng)管理、飼料、環(huán)境衛(wèi)生和氣候變化等有密切的關(guān)系，因此，臨床防治大腸桿菌病，水貂場應(yīng)嚴(yán)格控制飼養(yǎng)管理，不能混群飼養(yǎng)，同時要嚴(yán)格管理飼養(yǎng)衛(wèi)生，增強(qiáng)消毒意識，做到定期消毒， 減少環(huán)境中致病菌的含量，從而有效減少致病菌對水貂的侵害，氣候劇變時可以適當(dāng)使用藥物預(yù)防。飼喂安全的飼料可以有效減少水貂大腸桿菌病的發(fā)生。對來源不明的動物性飼料，必須經(jīng)高溫加工后方可飼喂[10]。

此次分離的10株水貂大腸桿菌對頭孢西叮、頭孢他啶和頭孢吡肟3種抗菌藥物的敏感率為100%，對其他15種抗菌藥物則表現(xiàn)為不同程度的耐藥，有2株大腸桿菌可對13種藥物同時耐藥。多重耐藥現(xiàn)象的出現(xiàn)與水貂細(xì)菌病防治中濫用抗菌藥物有很大關(guān)系，許多養(yǎng)殖戶不按照劑量及療程給藥治療，或在飼料及飲水中長期添加抗菌藥物進(jìn)行疾病預(yù)防，都會造成耐藥性提高。藥敏試驗結(jié)果表明，水貂發(fā)生細(xì)菌病后應(yīng)盡可能通過藥敏試驗篩選敏感藥物，避免盲目投藥。

參考文獻(xiàn)

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安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，Journal of Anhui Agri. Sci.2015，43（11）：127-128，131

責(zé)任編輯 陳玉敏 責(zé)任校對 況玲玲