籠養條件下花尾榛雞的遺傳多樣性分析

田萬年　鐘寶

摘要 [目的]探討籠養花尾榛雞的遺傳分化。[方法]采用PCR和DNA直接測序技術測定線粒體細胞色素Cyt b基因全序列，結合GeneBank收錄的其他松雞科同源序列，利用生物學軟件進行分析。[結果]15只花尾榛雞樣本Cyt b基因序列中，共檢測到核苷酸多態位點12個，具有6種單倍型，籠養吉林花尾榛雞遺傳多樣性水平較低。系統分析結果顯示，吉林花尾榛雞與松雞科榛雞屬親緣關系最近，與北美榛雞屬親緣關系較遠。[結論] 花尾榛雞屬于松雞科榛雞屬，不應并入北美榛雞屬。

關鍵詞 花尾榛雞；Cyt b基因；遺傳多樣性

中圖分類號 S864.3 文獻標識碼A 文章編號 0517-6611（2015）11-030-02

花尾榛雞（Bonasa bonasia）是雞形目雉科鳥類，俗稱飛龍，是東北地區典型的森林留鳥[1]。其在東北曾有大規模的分布，長期以來，因狩獵致使數量下降而成為國家Ⅱ級保護鳥類。目前國內對其飼養繁育及疾病等方面進行了較為深入的研究，但有關花尾榛雞的分子生態學方面研究尚未見報道。線粒體DNA（mtDNA）具有母性遺傳、進化速率快、拷貝數多的特點，是目前生物體研究中應用最廣泛的遺傳標記之一。 細胞色素b（Cyt b）是mtDNA編碼的呼吸鏈上重要的酶之一，作為一種高效的母系遺傳標記，已被廣泛應用于系統發育研究[2]。筆者以分子生態學研究中使用最為普遍的mtDNA的控制區和細胞色素b（Cyt b）作為分子標記，對花尾榛雞的遺傳多樣性進行分析，以期為制定科學的繁育計劃、對花尾榛雞進行遺傳保護提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 樣品的采集吉林花尾榛雞來自吉林市左家珍禽養殖場，采集不同個體花尾榛雞抗凝血15份，置于冰瓶帶回實驗室，-20 ℃保存備用。用全血基因組提取試劑盒提取基因組DNA。

1.2 Cyt b基因的擴增和序列測定根據GeneBank中已發表的松雞基因序列（AB120132），利用Primer Premier 5.0軟件設計一對引物。上游引物P1： 5'-ATG GCA CCC AAC ATC CGA AAA T-3'，下游引物P2：5'-TTA GTG GTT GAG TAT TTT GTT T -3'，預期擴增大小為1 143 bp。引物由上海英駿生物技術有限公司合成。PCR反應條件：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性45 s， 52 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，30個循環；72 ℃延伸5 min。PCR 產物的純化、回收和測序由上海英俊生物技術有限公司完成。

1.3 統計分析 應用Clustal W（1.82）軟件進行多序列比對，通過MEGA4.0 軟件計算不同序列間的核苷酸代替、變異位點、轉換顛換比率及遺傳距離等。用DNAsp4.10軟件計算單倍型、單倍型多樣性、核苷酸多樣性。利用MEGA 軟件計算品種間距離，利用UPGMA 法構建品種的分子系統樹。

2 結果與分析

2.1 花尾榛雞Cyt b基因PCR擴增結果通過DNA分子質量標準和測序結果得知，Cyt b基因PCR產物大小為1 143 bp，與預期結果一致。

2.2 花尾榛雞Cyt b基因的核苷酸多態位點的突變類型通過對15條花尾榛雞Cyt b基因序列（15條序列由該試驗測定，其余11條序列來源于GenBank）分析結果表明，所有序列全長均為1 143 bp，無插入和缺失，共發現12個變異位點，包括9個轉換和3個顛換。核苷酸的替換位點主要以轉換為主，表現出較高的轉換偏倚。12個變異位點定義了6種單倍型。

2.3 花尾榛雞Cyt b基因系統進化分析利用Clustal W（1.82）軟件對花尾榛雞mtDNA Cyt b序列進行同源序列對比，結果發現，15只花尾榛雞 Cyt b 基因全序列由6種單倍型組成。結合所有的群體單倍型序列，并引用GenBank中的部分松雞科Cyt b基因序列，采用UPGMA法，以Kimura雙參數模型構建系統發育樹。從圖2可以看出，基于Cyt b基因吉林花尾榛雞與榛雞屬Tetrastes bonasia（NC-020591）親緣關系最近，與斑尾榛雞（AF230166）處于一個分支，而北美榛雞屬（AF230167）單獨處于一個分支。黑琴雞（AF230166）、松雞（AF230179）和巖雷鳥（AY156346）共在一個分支上。

3 討論

花尾榛雞的肉質口感細嫩，肉味極其鮮美且具有良好的滋補作用和扶正固本的藥效，具有非常高的經濟價值[3]。近年來由于對花尾榛雞棲息地環境破壞及大量捕獵，花尾榛雞的野生數量急劇減少。目前， 我國關于花尾榛雞的研究主要集中在人工馴養和養殖、疾病防治、飼料及營養、人工孵化及育雛等方面[4-8]。 研究手段較單一，研究深度不夠，繁殖率低、幼雛成活率低等問題尚未能解決。因此，對花尾榛雞的遺傳、生理及進化等方面進行系統的研究為花尾榛雞的保

護及生產利用提供有效的保證。目前，對于花尾榛雞種群遺傳多樣性分析研究較少。楊秀芹等[9]對花尾榛雞MC4R基因進行了克隆和序列分析。蔡曉淇[3]對花尾榛雞的系統地位與BLB基因多態性進行了研究。該試驗測定和分析了吉林地區花尾榛雞15只樣本的mtDNA Cyt b基因序列，共檢測到12個多態位點，定義了6種單倍型。

目前我國對松雞科鳥類的種屬分類存在爭議，最早認為劃分為9屬。國內學者通過形態、分子系統學等方法認為應將劃分為7屬或6屬。對于花尾榛雞的分類地位主要集中北美榛雞屬Bonasia 和榛雞屬Tetrastes。該試驗通過測定花尾榛雞mtDNA Cyt b基因序列，構建系統發育樹結果表明，籠養吉林花尾榛雞與榛雞屬Tetrastes bonasia（NC-020591）親緣關系最近，與斑尾榛雞（AF230166）處于一個分支，而北美榛雞屬（AF230167）單獨處于一個分支。該研究支持花尾榛雞屬于松雞科榛雞屬，不應并入北美榛雞屬，與包新康等[4]、蔡曉淇等[10]的觀點一致。

參考文獻

[1]朱井麗.長白山東部山區越冬期花尾榛雞種群密度及分布[J].黑龍江生態工程職業學院學報，2011，24（3）：24-25.

[2] 劉向華，王義權，劉忠權，等.從Cytb基因序列探討鹿亞科動物的系統發生關系[J].動物學研究，2003，24（1）：27-33.

[3] 蔡曉淇.花尾榛雞的系統地位與BLB基因多態性研究[D].哈爾濱：東北林業大學，2013.

[4] 包新康，劉發，顧海軍，等.雞形目鳥類系統發生研究現狀[J].動物分類學報，2008，33（4）：720-732.

[5] 趙匠，易國棟，郝錫聯，等.珍禽花尾榛雞的研究現狀及展望[J].吉林師范大學學報，2006（2）： 60-61.

[6] 李愛國，李國君.花尾榛雞野生馴養方法[J].特種經濟動植物，2009（10）：8-9.

[7] 杜繼紅，周玉秋.花尾榛雞的養殖[J].中國禽業導刊，2006，23（18）：31-32.

[8] 孫淑霞，薛茗元，張克勤.花尾榛雞人工飼養技術[J].中國家禽，2014，36（6）：55-58.

[9] 楊秀芹，張冬杰，劉娣.環頸雉和花尾榛雞MC4R基因的克隆和序列分析[J].中國畜牧雜志，2010，46（17）：16-18.

[10] 蔡曉淇，白素英，金煜.松雞科13種鳥類COⅠ序列變異及系統發育分析[J].動物分類學報，2012，37（2）：269-273.