大黑鰓金龜消化與解毒相關基因的組織表達研究

嚴雅靜　胡飛　陳浩梁等

摘要[目的]明確大黑鰓金龜幼蟲消化酶和解毒相關基因在不同組織中的表達情況，篩選中腸特異表達基因。[方法]利用RTPCR方法對大黑鰓金龜幼蟲中腸消化酶（胰蛋白酶、氨肽酶、羧肽酶）基因和解毒相關基因（細胞色素P450、谷胱甘肽S轉移酶、酯酶）在不同組織中的表達進行分析。[結果]所調查的大黑鰓金龜的6個谷胱甘肽S轉移酶在中腸中都有表達，有3個基因在中腸中特異性表達。細胞色素P450家族中CYP 6A20和CYP 4C1 2個基因在中腸中特異表達，3個氨肽酶基因（APN1、APN2和AP2）只在中腸中表達。[結論] 大部分大黑鰓金龜的消化酶和解毒酶基因在中腸中表達量最高。

關鍵詞大黑鰓金龜；中腸；基因；表達量

中圖分類號S188文獻標識碼A文章編號0517-6611（2015）16-057-03

Tissue Expression of the Genes Related to Detoxification Enzymes and Digestive Proteinases of Holotrichia oblita

YAN Yajing1， HU Fei1， CHEN Haoliang2， WEI Zhaojun1* et al

（1. School of Biotechnology and Food Engineering， Hefei University of Technology， Hefei， Anhui 230009； 2. Institute of Plant Protection and Agricultural Products Quality Safety， Anhui Academy of Agricultural Sciences， Hefei， Anhui 230031）

Abstract[Objective] To clarify of the tissue expression of the genes related to detoxification enzymes and digestive proteinases and identify the specific expressed genes in the midgut from the larvae of Holotrichia oblita. [Method] The expression of the genes related to detoxification enzymes and digestive proteinases in epidermis， head， midgut and fat body genes were analyzd by RTPCR. [Result] All the six GSTs genes were expressed in the midgut， and three of them were expressed in midgut specifically. As to the genes from the P450 family， CYP 6A20 and CYP 4C1 genes specifically expressed in midgut. Three aminopeptidase were specifically expressed in the midgut， including APN1， APN2 and AP2. [Conclusion] The expression of most of the genes related to the digestive proteinases and detoxification enzymes in midgut are higher than in other tissues.

Key wordsHolotrichia oblita； Midgut； Genes； Expression

大黑鰓金龜（Holotrichia oblita），幼蟲俗稱蠐螬，對花生等農作物以及林木幼苗和草坪危害嚴重，造成大面積減產[1]。到目前為止，關于大黑鰓金龜幼蟲蠐螬的研究主要集中在發生規律和常規防治方面，對中腸和生物防治靶標分子生物學方面的研究很少[2]。由于大黑鰓金龜幼蟲生活在土壤中，土壤病原微生物在其取食植物根部的同時也一同侵入到消化道中，因此幼蟲的消化道環境很特殊[3]。中腸是消化道很重要的一部分，作為昆蟲的第二大器官[4]，具有分泌消化酶、消化食物和吸收營養的功能；同時也是外源殺蟲劑或天然毒素新陳代謝的地方[5]，從而成為病原微生物、農藥、各種毒素的作用靶標。中腸消化涉及到很多酶，如絲氨酸蛋白酶、羧肽酶、氨肽酶等。絲氨酸蛋白酶廣泛分布在所有動物和微生物中[6]。昆蟲中腸也是外源物新陳代謝的場所，解毒酶可以增強害蟲對農藥的轉化和降解作用，從而使毒性降低，或者通過阻隔作用來保護自己的靶標位點[7]。中腸中編碼解毒酶的高表達基因與殺蟲劑抗性有關，特別是谷胱甘肽S轉移酶（Glutathione Stransferases，GSTs）、非專一性酯酶（ESTs）和細胞色素P450三大超基因家族[5]。

筆者在前期開展轉錄組分析的基礎上，篩選了一些與中腸消化和解毒相關的基因，利用RTPCR方法對這些基因在不同組織中的表達模式進行研究，以期為尋找生物防治新靶標以及研究抗藥性機理，進一步開展大黑鰓金龜的生物防治奠定基礎。

1材料與方法

1.1材料

大黑鰓金龜飼養條件：溫度25～30 ℃，土壤含水量18%～20%。解剖大黑鰓金龜幼蟲的中腸、表皮、頭、脂肪體，整個操作在冰上進行，將解剖的組織分別裝入1.5 ml離心管中，立即投入液氮冷凍，于-80 ℃保存備用。

1.2大黑鰓金龜幼蟲組織總RNA的提取

提取總RNA用到的器具（勻漿器、移液器槍頭、EP管等）要用DEPC水浸泡過夜，高溫高壓使DEPC水失活，置于烘箱中烘干備用，抽提RNA使用RNAiso Plus試劑盒，具體操作參照試劑盒說明進行。總RNA經瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計檢測。

1.3cDNA的合成

分別以表皮、頭、中腸、脂肪體中的總RNA為模板，經反轉錄成cDNA，具體操作參照試劑盒說明進行。cDNA合成反應50 μl體系包括：PrimeScriptTM Buffer 10 μl，PrimeScriptTM RT Enzyme Mix I 2.5 μl，Oligo dT Primer（50 μmol/L）2.5 μl，Random 6 mers（100 μmol/L）10 μl，RNA 4 μg，加RNase Free ddH2O到50 μl。于37 ℃反應15 min，85 ℃ 5 s使酶失活。

1.4引物設計與合成

根據前期測定的轉錄組數據，設計大黑鰓金龜幼蟲解毒酶和消化酶相關引物，引物序列見表1。引物設計后交上海生物工程公司合成。

1.5RTPCR

PCR反應體系25 μl：10×PCR buffer 2.5 μl，dNTPs（2.5 mmol/L） 2 μl，Primer 1（10 μmol/L） 1 μl，Primer 2（10 μmol/L）1 μl，模板 0.5 μl，Taq酶 0.2 μl，加ddH2O到 25 μl。PCR反應程序：94 ℃預變性5 min；95 ℃變性1 min，55 ℃退火1 min，72 ℃延伸90 s，30個循環；最后72 ℃延伸10 min。PCR產物使用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

表1RTPCR引物序列

擴增基因引物引物序列（5′-3′）片段長度bp

2結果與分析

2.1GSTs基因在不同組織的表達

6種GSTs基因在大黑鰓金龜幼蟲的中腸中都有表達，GST 12、GST2和GST sigma 3種基因只在中腸特異表達。GST Omega和GST Delta 2個基因在表皮、頭、中腸、脂肪體中都表達。同時GST11基因在表皮、中腸和脂肪體中表達，在頭中不表達（圖1）。昆蟲谷胱甘肽S轉移酶在解毒代謝和殺蟲劑抗性中起重要作用，中腸是昆蟲解毒的重要器官，除中腸外，昆蟲脂肪體也是解毒和儲存營養物質的器官[8]。昆蟲中GSTs在除中腸外的其他組織中表達，預示著這種酶可能參與昆蟲其他的生理過程，是為了適應環境長期進化的結果。

圖1大黑鰓金龜幼蟲GSTs基因在不同組織中的表達

2.2細胞色素P450基因在不同組織的表達

所檢測的11個P450家族基因中，僅CYP 4C和CYP 6A20 2個基因在中腸特異表達；CYP 6K1在中腸中不表達。CYP 9E2、CYP 6A8、CYP 6A23、CYP 6A17和CYP 6A1在4個組織中都有表達，CYP 9E2在中腸表達量較高，在其他組織表達量低，CYP 6A23和CYP 6A14基因片段在4個組織中表達量無明顯差異（圖2）。P450基因主要在中腸中高表達，其次在脂肪體中表達量也很高，只有少量 P450 基因在表皮和頭中有較高水平的表達，這預示著P450可能參與了大黑鰓金龜幼蟲解毒器官的解毒代謝。P450基因在表皮和頭中的表達，預示著這幾類P450可能還具有其他功能。

2.3酯酶在不同組織的表達

共檢測了7個酯酶相關基因包括3個羧酸酯酶基因（carboxylesterase6，CarE61，CarE62，CarE63），2個酯酶esterase FE4（Est FE41，Est FE42）基因，1個酯酶esterase E4（Est E4）基因和1個酯酶esterase B1（Est B1）基因。Est FE41和Est FE42 2個基因只在中腸組織中特異表達，在表皮、頭和脂肪體中不表達。Est E4、CarE62、CarE63在4個組織中都有表達，Est E4和CarE62基因片段在中腸中表達量最高（圖3）。酯酶是除P450和GSTs外的第3個重要的昆蟲解毒酶系，能夠降解多種殺蟲劑。羧酸酯酶是酯酶中重要的一類，也參與昆蟲的解毒過程[9]。該試驗中Est FE41和Est FE42在中腸中特異性表達，中腸是昆蟲最重要的解毒器官之一，推測這2個基因與昆蟲解毒相關。

圖2大黑鰓金龜幼蟲細胞色素P450相關基因在不同組織中的表達

圖3大黑鰓金龜幼蟲酯酶相關基因在不同組織中的表達

2.4消化酶相關基因在不同組織的表達

共檢測了7個消化酶相關基因在大黑鰓金龜幼蟲組織中的表達情況，分別為3個氨肽酶基因（APN1，APN2，AP2），2個胰蛋白酶基因（TPS1，TPS 3A1）和2個羧肽酶基因（CPs B，Zinc CPs A1）。APN1、APN2、AP2、TPS1、CPs B這5個基因片段在中腸中特異性表達，在表皮、頭和脂肪體中都不表達（圖4）。其中羧肽酶Zinc CPs A1基因在4個組織中都有表達，但在中腸中表達量最高。

圖4大黑鰓金龜幼蟲消化酶基因在不同組織中的表達

3結論與討論

該研究采用RTPCR法對消化和解毒的功能基因在不同組織中的表達進行分析，結果發現，同一個基因在不同組織部位表達量不同，不同基因在同一組織中的表達量也有差異，大部分基因在中腸中條帶最亮，說明這些基因在中腸中表達量最高，其中一些基因在中腸中特異性高表達。該研究主要對中腸解毒和消化相關的基因進行了表達分析，大部分解毒酶基因（如谷胱甘肽硫轉移酶基因和P450基因）在中腸中高表達，其中一部分基因在脂肪體中表達量也很高，推測脂肪體和中腸是大黑鰓金龜的主要解毒器官；消化酶相關基因在中腸中表達量最高，這與中腸消化功能一致。

這些中腸中高表達的基因，需要今后采用更多的技術方法進一步探索這些基因在大黑鰓金龜體內的功能，對于昆蟲抗藥性的研究具有一定意義。

43卷16期

嚴雅靜等大黑鰓金龜消化與解毒相關基因的組織表達研究

參考文獻

[1] 周洪旭，李長友，李國勛.草坪害蟲華北大黑鰓金龜幼蟲圍食膜蛋白HoPeritrophin3基因克隆及序列分析[J].草葉學報，2010，19（6）：147-153.

[2] 劉小民，張霞，李杰，等.花生蠐螬中腸組織cDNA文庫的構建[J].花生學報，2010，39（1）：15-19.

[3] ZHOU H X，TAN X M，LI C Y，et al.The Peritrophic matrix of two grubs，Holotrichia oblita and H.parallela （Coleoptera：Melolonthidae）and the effects of Helicoverpa armigera（Lepidoptera：Noctuidae）granulovirus enhancin on its structure[J].Entomological News，2009，120（5）：509-517.

[4] HAKIM R S，BALDWIN K，SMAGGHE G.Regulation of midgut growth，development，and metamorphosis[J].Ann Rev Entomol，2010，55：593-608.

[5] SHEN G M，DOU W，HUANG Y，et al.In silico cloning and annotation of genes involved in the digestion，detoxification and RNA interference mechanism in the midgut of Bactrocera dorsalis [Hendel（Diptera：Tephritidae）[J].Insect Molecular Biology，2013，22（4）：354-365.