飼用枯草芽孢桿菌發(fā)酵工藝的優(yōu)化及菌劑制備

吳東　劉惠琴　徐力　田永強

摘要 [目的] 為飼用枯草芽孢桿菌的大規(guī)模生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。[方法] 通過單因素試驗和正交試驗，對發(fā)酵培養(yǎng)基配方及其發(fā)酵條件進行優(yōu)化。[結(jié)果] 飼用枯草芽孢桿菌的最佳培養(yǎng)基為：葡萄糖3%、酵母浸膏1.5%、磷酸氫二鈉0.2%、磷酸二氫鈉0.1%、硫酸鎂0.1%、酵母浸粉0.5%。飼用枯草芽孢桿菌的的最適發(fā)酵條件為：溫度38 ℃，初始 pH 7.0～7.2，搖床轉(zhuǎn)速 180 r/min，接種量 7%。選擇木屑質(zhì)量與發(fā)酵液體積（m/V）的混合比為3∶5，繼續(xù)高溫發(fā)酵16 h，芽飽產(chǎn)量可達到5.18×1010 CFU/g。[結(jié)論] 該研究可為飼用枯草芽孢桿菌的工業(yè)化生產(chǎn)提供了數(shù)據(jù)支持。

關(guān)鍵詞 枯草芽孢桿菌；發(fā)酵工藝；優(yōu)化；菌劑；制備

中圖分類號 S816.6 文獻標識碼 A 文章編號 0517-6611（2015）19-134-04

飼用抗生素的使用在我國過去的很多年內(nèi)對養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展作出了突出的貢獻。但是，隨著社會和科技的發(fā)展，人們對食品安全越來越重視，抗生素產(chǎn)生一系列負面問題（如耐藥性），引起飼料用藥及治療用藥量越來越高，并且過量使用抗生素容易導(dǎo)致動物生產(chǎn)能力降低[1]?？莶菅挎邨U菌是芽孢桿菌屬的一種，由于其在自然界廣泛分布，枯草芽孢桿菌產(chǎn)生孢子時能分泌許多種酶類物質(zhì)和生長因子，穩(wěn)定性極好，具有耐氧化、抗擠壓、耐高溫、耐酸等特征[2]。此外，枯草芽孢桿菌抗逆性很強，能夠儲藏的時間較長，它在顆?；蚍哿现卸加休^強的穩(wěn)定性，也能夠很通順地進入動物的大小腸道生存并且能夠大范圍繁殖，是在微生物飼料添加劑中應(yīng)用最為廣泛的益生菌?？莶菅挎邨U菌不污染環(huán)境，不破壞生態(tài)，能夠抑制許多病原菌[3-6]。它還有一個最大的優(yōu)勢就是能夠產(chǎn)生內(nèi)生芽孢，抗逆性強，在土壤和植物表面普遍存在，其芽孢可以制成粉劑和可濕性粉劑等各種生防制劑應(yīng)用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)，該制劑具有與化學(xué)農(nóng)藥混用而不失活的特性[7-9]。制劑中的芽孢含量是影響制劑應(yīng)用效果的關(guān)鍵因素。通過優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基配方及其發(fā)酵條件，提高發(fā)酵液中芽孢含量，以期為大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)，有助于降低生產(chǎn)成本和提高制劑的生防效果。

1 材料與方法

1.1 試驗用培養(yǎng)基

1.1.1 種子培養(yǎng)基。 LB培養(yǎng)基：蛋白胨10 g/L、酵母提取物5 g/L、氯化鈉10 g/L[10-13]。

1.1.2 基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基。蔗糖20 g/L、蛋白胨15 g/L、酵母浸粉5 g/L，MgSO4 1 g/L， KH2PO4 2 g/L、K2HPO4 2 g/L，水1 000 ml，將pH調(diào)節(jié)至7.0，用于枯草芽孢桿菌發(fā)酵培養(yǎng)。

1.2 菌種 枯草芽孢桿菌CM0002，購于中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心提供。

1.3 儀器與設(shè)備 控溫搖床、高壓蒸氣滅菌鍋、電子天平、pH測定儀、無菌操作臺和紫外分光光度計。

1.4 試驗方法

1.4.1 菌種活化。 將保存的菌種轉(zhuǎn)接到斜面培養(yǎng)基，30 ℃培養(yǎng)24 h，活化3次，備用。

1.4.2 種子液的制備。 將保存的枯草芽抱桿菌接于新鮮培養(yǎng)皿平板，35 ℃條件下培養(yǎng)24 h，取培養(yǎng)好的平板菌種再接種于盛有50 ml種子培養(yǎng)基的250 ml三角燒瓶中，搖床35 ℃、160 r/min培養(yǎng)20 h。

1.4.3 生長趨勢的測定。 取培養(yǎng)好的斜面種子，用接種環(huán)挑2環(huán)接種于盛有50 ml無菌種子培養(yǎng)基的250 ml三角瓶中，培養(yǎng)20 h，按照5%接種于盛有50 ml基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基的250 ml三角瓶中，按照上述試驗確定的最優(yōu)化的培養(yǎng)基并采用搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)條件培養(yǎng)30 h。自接種后每2 h 取樣1 次測定菌發(fā)酵培養(yǎng)基的菌液的OD600，直至36 h。用未接種的培養(yǎng)基作為空白對照。

1.4.4 搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)。 分別用移液槍移動2.5 ml種子液，接入盛有50 ml/250 ml基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基的三角瓶中（接種量為5%，V/V）。置于搖床中，35 ℃條件下振蕩培養(yǎng)22 h，轉(zhuǎn)速為160 r/min，初始pH為7.0。

1.4.5 活菌生物量的測定。采用平板菌落計數(shù)法計數(shù)。

1.4.6 培養(yǎng)基的單因素試驗。

①最佳碳源的篩選。分別用葡萄糖、麥芽糖、乳糖、牛肉膏采用相同的2%的添加量替換蔗糖，接種與培養(yǎng)條件不變，培養(yǎng)22 h后測定菌液的OD600 nm。用未接種的培養(yǎng)基作為空白對照，以確定最佳的碳源。每個處理3個重復(fù)，取平均值。②最佳氮源的篩選。分別用胰蛋白胨、酵母浸膏、尿素、硫酸銨采用相同的1.5%的添加量替換蛋白胨，培養(yǎng)與處理方法同上。

③無機鹽的篩選。分別用0.4%的NaH2PO4（0.2%）+Na2HPO4（0.2%）、CaCl2、CaCO3等量替代基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基中的中0.2%NaH2PO4的與0.2%的Na2HPO4的復(fù)合鹽，培養(yǎng)與處理方法同上，配制培養(yǎng)基進行發(fā)酵培養(yǎng)。

④發(fā)酵培養(yǎng)基營養(yǎng)成分的正交優(yōu)化。

將篩選出的最佳碳源設(shè)置1%、2%、3%3個處理，最佳氮源設(shè)置1.0%、1.5%、2.0%3個處理，最佳無機鹽設(shè)置0.1%、0.2%、0.3%3個處理，進行正交試驗。接種與培養(yǎng)條件不變，測定發(fā)酵液的OD600。用未接種的培養(yǎng)基作為空白對照，以確定各主要營養(yǎng)成分在發(fā)酵培養(yǎng)基中的添加比例。

1.4.7 培養(yǎng)條件的單因素優(yōu)化試驗。

采用最適培養(yǎng)基配方和固定搖瓶培養(yǎng)，對發(fā)酵時間、溫度、初始pH、轉(zhuǎn)速、接種量及裝液量進行逐一優(yōu)化。①最佳培養(yǎng)溫度的優(yōu)化。按照優(yōu)化后的培養(yǎng)基配方對枯草芽抱桿菌進行培養(yǎng)，接種量5%，pH 7.0，將接種后的培養(yǎng)基分別置于29、32、35、38、41 ℃條件下振蕩培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速為160 r/min，22 h后測定菌液的OD600 nm。用未接種的培養(yǎng)基作為空白對照，每個處理3個重復(fù)，取平均值。

②最佳初始pH的優(yōu)化。

按照優(yōu)化后的培養(yǎng)基配方及培養(yǎng)溫度對枯草芽抱桿菌進行培養(yǎng)，接種量5%，初始pH分別設(shè)置為5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0，轉(zhuǎn)速160 r/min振蕩培養(yǎng)。處理方法同上。

③最佳接種量的優(yōu)化。將枯草芽抱桿菌分別以1%、3%、5%、7%和9%的接種量接種于優(yōu)化后的培養(yǎng)基中，并按照優(yōu)化后的培養(yǎng)條件，轉(zhuǎn)速160 r/min振蕩培養(yǎng)。處理方法同上。④最佳裝液量的優(yōu)化。

將培養(yǎng)好的種子液以最優(yōu)接種量分別接于30、40、50、60、70 ml的已優(yōu)化的基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基中，在最優(yōu)條件下進行培養(yǎng)，測定菌液的OD600nm。用未接種的培養(yǎng)基作為空白對照。

⑤最佳搖床轉(zhuǎn)速的優(yōu)化。

按照優(yōu)化后的培養(yǎng)基配方、接種量、裝液量、初始pH和培養(yǎng)溫度對枯草芽抱桿菌進行培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速分別設(shè)置為120、140、160、180和200 r/min振蕩培養(yǎng)，處理方法同上。

1.4.8 枯草芽孢桿菌芽孢制備及干菌粉制備。①枯草芽孢桿菌芽孢的制備。將枯草芽孢桿菌接種于優(yōu)化好的發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)完成后，在發(fā)酵好的枯草芽孢桿菌發(fā)酵液中分別加入等量的經(jīng)研磨、滅菌的（麻子秸稈粉、青草粉、木屑）放入40恒溫水浴鍋中繼續(xù)培養(yǎng)16 h后將混合有（麻子秸稈粉、青草粉、木屑）的發(fā)酵液放入80水浴鍋中水浴10 min，取樣品1 g放入滅菌試管，進行梯度稀釋，取稀釋液0.5 ml，倒入LB固體培養(yǎng)基中涂布培養(yǎng)30 h后計數(shù)。

②枯草芽孢桿菌干菌粉的制備。將發(fā)酵好的枯草芽孢桿菌發(fā)酵液中分別加入等量的經(jīng)研磨、滅菌的（麻子秸稈粉、青草粉、木屑）放入40恒溫水浴鍋中繼續(xù)培養(yǎng)16 h后，取出放入正空恒溫干燥箱中干燥，制備干菌粉。

2 結(jié)果與分析

2.1 生長曲線的測定

[14] 取培養(yǎng)好的平板，用接種環(huán)挑2環(huán)接種于盛有50 ml/250 ml無菌種子培養(yǎng)基中，培養(yǎng)20 h后按5%接種量接入已經(jīng)最優(yōu)化的培養(yǎng)基，并采用搖瓶培養(yǎng)發(fā)酵培養(yǎng)30 h。自接種后每2 h取樣1次測定菌液的OD600，用未接種的培養(yǎng)基作為空白對照。從圖1可以看出，發(fā)酵培養(yǎng)0～2 h為枯草芽孢桿菌的生長延緩期，細菌生長極慢；2 h以后逐漸進入對數(shù)生長期，菌體數(shù)量急劇增多；在17 h達到生長高峰期，12～17 h為枯草芽孢桿菌生長的穩(wěn)定期，菌體生長緩慢。17 h以后細菌數(shù)量開始減少，枯草芽孢桿菌進入生長衰亡期。因此，采用培養(yǎng)17 h的菌液作為菌種比較合適，此時枯草芽孢桿菌為對數(shù)生長末期，既可保持高的細胞活力，又可獲得盡可能多的菌體生物量。

2.2 發(fā)酵培養(yǎng)基營養(yǎng)成分的優(yōu)化

2.2.1 最佳碳源的篩選。從圖2可以看出，以葡萄糖作為碳源時，枯草芽抱桿菌的生物量最大。葡萄糖可以在細胞生長時期作為枯草芽抱桿菌的最佳碳源，同時可以作為細胞合成的前體的物質(zhì)，因此選擇葡萄糖作為最佳碳源。

2.2.2 最佳氮源的篩選。

從圖3可以看出，以酵母浸膏作為氮源時，枯草芽抱桿菌的生長量最大。因此，枯草芽孢桿菌的最佳氮源是酵母浸膏。

2.2.3 無機鹽的篩選。

從圖4可以看出，以Na2HPO4+NaH2PO4（1∶1）作為無機鹽時，枯草芽抱桿菌的生長量最大。因此，枯草芽抱桿菌的最佳無機鹽為Na2HPO4+NaH2PO4（二者比例為1∶1）。

2.3 發(fā)酵培養(yǎng)基營養(yǎng)成分含量的正交優(yōu)化

[14] 由表1可知，這3種營養(yǎng)成分對枯草芽孢桿菌生長的影響大小順序為：酵母浸膏>葡萄糖>無機鹽。3種營養(yǎng)成分經(jīng)優(yōu)化后最

佳的配比為：3%葡萄糖、1.5%酵母膏、0.2%磷酸氫二鈉、

2.4 發(fā)酵培養(yǎng)條件的優(yōu)化

2.4.1 最佳溫度的確定。從圖5可以看出，枯草芽抱桿菌的最適培養(yǎng)溫度是35 ℃。

2.4.2 最佳初始pH的確定。從圖6可以看出，液體發(fā)酵培養(yǎng)枯草芽抱桿菌時的最適初始pH應(yīng)為7.0～7.5。

2.4.3 最佳接種量的確定。從圖7可以看出，當接種量為7%時，發(fā)酵液中枯草芽抱桿菌的活菌數(shù)量達到最大，因此最佳的接種量應(yīng)為7%。

2.4.4 最佳裝液量的確定。從圖8可以看出，當其他條件最優(yōu)時，最佳的裝液量為30 ml置于250 ml三角瓶中發(fā)酵。

2.4.5 最佳搖床轉(zhuǎn)速的確定。從圖9可以看出，液體發(fā)酵培養(yǎng)枯草芽抱桿菌時的最適培養(yǎng)轉(zhuǎn)速應(yīng)為200 r/min。

2.5 枯草芽孢桿菌芽孢的制備 由表2可知，不同的固相支持物對枯草芽孢桿菌發(fā)酵液形成芽孢有較好的促進作用，其中木屑對飼用枯草芽孢桿菌產(chǎn)芽孢率有明顯的促進作用，其原因主要可能是發(fā)酵液里面的枯草芽孢桿菌菌體能夠借助固相支持物本身進行吸附及同時借助固相支持物之間相互形成的空隙阻斷營養(yǎng)物質(zhì)的供應(yīng)對芽孢形成起到促進作用。因此，最后選擇木屑質(zhì)量與發(fā)酵液體積的比例為3∶5，以提高發(fā)酵液芽孢產(chǎn)率。

2.6 枯草芽孢桿菌干菌粉的制備 將發(fā)酵好的枯草芽孢桿菌發(fā)酵液中分別加入經(jīng)研磨、滅菌的木屑（與發(fā)酵液體積的比例為3∶5）放入40恒溫水浴鍋中繼續(xù)培養(yǎng)。取出目的產(chǎn)物放入正空恒溫干燥箱中干燥，等全部的物質(zhì)干燥完成后研磨制備成干菌粉。

3 小結(jié)

筆者通過搖瓶發(fā)酵對枯草芽孢桿菌培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件

進行了初步研究，結(jié)果表明不同的培養(yǎng)條件、不同的碳氮源無機鹽及不同配比對枯草芽孢桿菌的生物量有很大的影響。培養(yǎng)溫度35 ℃、初始pH 7.0～7.5、裝液量30 ml和接種量7%的基礎(chǔ)培養(yǎng)液中振蕩培養(yǎng)17 h，可以使菌體生物量達到最大值（7.90×109 CFU/g）。通過正交試驗得到枯草芽孢桿菌的最佳培養(yǎng)基為：葡萄糖3%、酵母膏1.5%、磷酸氫二鈉0.2%、磷酸二氫鈉0.1%。該試驗結(jié)果僅是在三角瓶培養(yǎng)水平上獲得的，但若要實現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化開發(fā)，還需要進行固體反應(yīng)器條件下的中間放大試驗，同時該試驗也為其工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)微生物農(nóng)藥劑奠定了一定的實踐基礎(chǔ)。

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