湖北利川黃連HPLC指紋圖譜研究

張亮　龍瀾　楊永康　李亞杰　李紅英　田騰飛

摘要 [目的]建立湖北利川黃連的高效液相色譜指紋圖譜， 為評價其質量提供科學、有效的方法。[方法]采用C18色譜柱， 乙腈-0.05 mol/L磷酸梯度洗脫； 流速為1.0 ml/min， 檢測波長354 nm；柱溫為35 ℃。[結果]對湖北利川黃連10批次藥材進行指紋圖譜分析， 通過HPLC技術指認指紋圖譜共有12個共有峰，共有峰總面積92.31%～95.67%，相似度0.940～0.986。乙腈-0.05 mol/L磷酸進行梯度洗脫最佳。[結論]該方法具有較好的穩定性和準確性，10個批次的黃連樣品生成的指紋圖譜可作為湖北利川黃連的標準指紋圖譜。

關鍵詞 黃連；指紋圖譜；HPLC

中圖分類號 S188；R284.1 文獻標識碼 A 文章編號 0517-6611（2015）19-030-02

黃連（Coptis Chinensis）屬毛茛科植物，藥用最早記載于《神農本草經》[1]，具有清熱燥濕、瀉火解毒的功效，主要用于小兒驚癇、瀉痢、骨蒸癆熱、黃疸等癥[2]。現代醫學研究表明，黃連中含有小檗堿、巴馬丁、黃連堿、甲基黃連堿、藥根堿和及少量的有機酸等[3-4]。目前，用于黃連指紋圖譜的分析方法有毛細管電泳法、紅外光譜法、高效液相色譜法、核磁氫譜法等[5-8]。筆者采用高效液相色譜法，對湖北利川黃連進行分析，并制定出湖北利川黃連的指紋圖譜，為黃連藥材的質量評價提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

黃連樣品來源見表1。

1.2 儀器與試劑 戴安液相3000；KQ-250D型超聲波清洗器；鹽酸小檗堿對照品（上海源葉生物科技有限公司），色譜乙腈，去離子水，甲醇、磷酸二氫鉀、鹽酸等試劑均為分析純。

1.3 方法

1.3.1 色譜條件。

檢測波長：354 nm，流速：1.0 ml/min，柱溫：25 ℃，柱子：Kromasil C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）。黃連指紋圖譜梯度流動相見表2。

1.3.2 對照品溶液的制備。取鹽酸小檗堿對照品適量，用甲醇分別配制成含鹽酸小檗堿100 μg/ml的對照品溶液。

1.3.3

供試品的制備。精確稱取黃連藥材（粉碎過4號篩） 0.50 g，置具塞錐形瓶中，精密稱定，分別精密加入甲醇∶鹽酸（100∶1，V/V）30 ml，超聲波提取40 min，過濾，定容于50 ml容量瓶中，搖勻，作為供試品。

1.3.4 指紋圖譜的制備方法。精密吸取對照溶液和和供試品溶液各20 μl注入液相色譜儀中，按“1.3.1”的色譜條件測定。

2 結果與分析

2.1 精密度

按照“1.3.1”的色譜條件連續進同一供試品溶液5次，考察色譜峰相對保留時間和相對峰面積的一致性。結果12個共有峰的保留時間RSD為0.43%～1.25%，主要色譜峰的相對峰面積RSD為0.61%～1.38%。

2.2 穩定性

取同一供試品溶液，每2 h測定一次，考察色譜峰相對保留時間和相對峰面積的一致性。結果12個共有峰的保留時間和主要色譜峰的相對峰面積基本一致，RSD分別為0.52%～1.47%、0.71%～1.89%，表明供試品溶液在12 h內穩定。

2.3 重復性

取黃連藥材5份，按照“1.3.3”的方法平行制備5份供試品，依法測定，考察色譜峰相對保留時間和相對峰面積的一致性。結果12個共有峰的保留時間和主要色譜峰的相對峰面積基本一致，RSD分別為0.63%～1.37%，0.58%～1.61%，表明該方法的重復性較好。

2.4 黃連指紋圖譜的建立

2.4.1 共有峰的確定。取表1中的10批黃連藥材，按“1.3.3”的方法制備供試品溶液進樣測定。鹽酸小檗堿對照品和10批黃連藥材指紋色譜圖見圖1、2。比較其色譜圖，得到12個共有指紋峰，且共有指紋峰的面積占總峰面積的90%以上，以鹽酸小檗堿的色譜峰為參照峰（相對保留時間α和相對峰面積RA均為1），計算色譜圖中各共有峰的相對保留時間和相對峰面積，結果見表3、4。

10個批次黃連藥材相對保留時間的RSD為0.19%～0.37%，表明樣品各共有峰之間的重合性好。相對保留峰面積RSD在5.79%～16.54%。每一個樣品所得到的非共有峰

總面積均小于10%，符合指紋圖譜研究要求的非共有峰占總峰面積百分比< 10%的規定。

2.4.2 相似度的計算。 將10批藥材出峰數據導入“中藥指紋圖譜計算機輔助相似度計算軟件”輔助自動進行峰匹配，

確定12共有峰，10批次黃連藥材的相似度在0.940～0.986（表5），表明所建立指紋圖譜的技術指標穩定，重現性好。

3 結論與討論

（1）該研究對象為產于湖北利川黃連的干燥根皮，考察了不同提取劑、不同提取方法和時間的提取效果，結果以甲醇∶鹽酸（100∶1，V/V），超聲波提取40 min為最佳。該方法操作簡單、穩定，重現性好，為研究黃連的化學成分變化、全面評價黃連藥材的質量提供了一種有效的方法。

（2）該研究對黃連指紋圖譜色譜條件進行了考察，在流動相的選擇中，分別以甲醇-0.05 mol/L磷酸二氫鉀、乙腈-0.05 mol/L磷酸、乙腈-1%甲酸、甲醇-1%甲酸等不同體積分數流動相系統進行等度和梯度洗脫試驗。結果表明，乙腈-0.05 mol/L磷酸進行梯度洗脫最佳，能把大部分峰有效地分開，有利于指紋圖譜的分析。

（3）通過色譜圖，確認10個黃連藥材有12個共有峰 ，以12號強峰作為參照峰，并計算相對保留時間和相對保留峰面積。共有峰的峰面積占總峰面積的92.31%～95.67%，符合指紋圖譜研究共有峰面積大于90%的規定。

（4）研究湖北利川黃連的指紋圖譜，按照該研究所提供的方法進行色譜分析，將10批次藥材的色譜數據導入衛生部藥典委員會頒布的“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統”（2004版）軟件對黃連指紋圖譜進行相似度計算。結果表明，以10個批次黃連藥材相對峰面積的均值作為對照模板，相似度在0.940～0.986。該方法操作簡單，重現性強，專屬性好，能較好地體現黃連藥材成分的整體性。

參考文獻

[1] 國家藥典委員會.中國藥典2000版[M].北京：化學工業出版社，2000.

[2] 陳曉兒.綜述黃連有效成分及藥理作用[J].學會，2002（4）：64-68.

[3] 徐國鈞，徐珞珊.常用中藥材品種整理和質量研究[M].福州：福建科學技術出版社，1992：505-508.

[4] 王答棋，賀震旦，馮寶樹，等.西藏胡黃連的化學成分[J].云南植物研究，1993，12（15）：831-842.

[5] 戴開金，羅奇志，羅佳波，等.黃連藥材及葛根芩連方中黃連生物堿毛細管電泳分析[J].中藥材，2004，27（3）：247-259.

[6] 李英明，王立群，鄧芬，等.黃連藥材不同部位、不同生長年限和不同海拔高度紅外光譜法整體分析與評價[J].中國醫學科學院學報，2004，26（6）：622-624.

[7] 秦海林，李志宏，王鵬，等.黃連專屬性對照物質及其指紋圖譜的創建[J].中國醫學科學院學報，2004，26（6）：625-627.

[8] 張銘，孫敏，樊宏偉.胡黃連藥材的指紋圖譜研究[J].生物學雜志，2009，26（1）：11-13.