毛細管微萃取結合熒光光譜法快速測定全血中異丙酚含量的研究

李莉　王慶振

摘要 [目的]建立在毛細管微反應器中快速萃取結合熒光光譜法測定全血中異丙酚含量的新方法。[方法]優化的條件為：5 ml環己烷為萃取劑，1 ml甲醇為沉淀劑，萃取3 min。[結果]在優化條件下異丙酚的平均萃取率大于99%，方法的線性范圍為0.05～10.00 μg/ml。日內相對標準偏差小于2%。[結論]毛細管微反應器萃取血樣中異丙酚的方法方便、可行。

關鍵詞 異丙酚；全血；毛細管微反應器；萃取

中圖分類號 S-03 文獻標識碼 A 文章編號 0517-6611（2015）19-023-02

異丙酚是一新型全身靜脈麻醉藥，因其起效迅速、作用短暫、復常良好且不良反應少，麻醉過程平穩、易于控制，其清除率高且有較高的脂溶性，連續長時間使用后并不出現藥物體內明顯的蓄積[1-3]。這是一種較好的靶控輸注系統藥物。異丙酚在體內代謝速度快，個體差異大，需要快速對異丙酚血藥濃度進行監測。異丙酚血液樣品的前處理方法主要有沉淀法、液-液萃取法及固相萃取法[4]，但操作繁瑣，不利于樣品的快速分析。建立快速異丙酚的前處理方法，對臨床用藥的安全、有效具有重要意義[5]。該研究利用在毛細管微反應器中的螺旋運動[6-7]，在短時間內實現樣品的高效分配，分離后靜置，直接取樣分析，但目前涉及毛細管微反應器中萃取方法尚未見報道。

1 材料與方法

1.1 溶液配制 分別精密稱取3.12 g磷酸二氫鈉、7.16 g磷酸氫二鈉，用蒸餾水定容到 100 ml容量瓶，濃度均為0.2 mol/L。然后，量取0.2 mol/L磷酸二氫鈉51 ml和0.2 mol/L磷酸氫二鈉49 ml，混合，用pH計調節，配成pH 6.8緩沖液。

準確稱取10 mg異丙酚，用甲醇溶解，并且定容至10 ml，配制成1 000 μg/ml 異丙酚儲備液。標準溶液由一定體積的儲備液稀釋制得。

1.2 樣品測定 試驗裝置見圖1。首先從3號通道吸取 1 ml甲醇，注入集液瓶，其次從2號通道吸取 1.0 ml SD大鼠新鮮全血，然后從5號通道吸取1 ml磷酸鹽緩沖液，最后從4號通道吸取5 ml環己烷，在毛細管中混合，充分混合后從1號排出，靜置3 min，用微量進樣器吸取上層有機層進行熒光分析（狹縫 3 nm/5 nm，OR=3；激發波長λex=262 nm，發射波長λem=285 nm）。加標樣品除在樣品中加入實量異丙酚外，其他步驟同上。

2 結果與分析

2.1 萃取條件優化

2.1.1 萃取劑種類與用量。分別以環己烷、環己烷∶正丁醇（95∶5）各5 ml為萃取劑，以1 ml 甲醇為沉淀劑，研究它們對2.5 μg/ml異丙酚血樣萃取效果的影響。由表1可知，萃取劑對異丙酚血樣均有一定程度的萃取能力，相應的萃取率分別為 100.8%、106.6%，RSD分別為9.8%、25.2%。環己烷∶正丁醇萃取率較高，但是RSD較高。因此，選擇環己烷作為萃取劑。然而，在保證環己烷對目標物具有較好萃取率且降低環境毒性的條件下，其用量應盡可能少。因此，考察環己烷用量 （3.5、4.0、5.0和6.0 ml）對異丙酚萃取的影響。結果表明，當環己烷用量小于5.0 ml時，異丙酚的萃取率隨著環己烷用量的增加而大幅度增加；當環己烷用量大于5.0 ml時，異丙酚的萃取率增加幅度較小。因此，環己烷的最佳用量為5.0 ml。

2.1.2 萃取時間。由表2可知，最佳萃取時間為3 min，平均萃取率為98.5%，RSD為16.8%。

2.1.3 毛細管的長度與直徑。由表3可知，最佳萃取長度為1.0 m，平均萃取率為100.2%，RSD為9.32%。與此同時，考察了毛細管直徑（0.762、1.000、0.508 mm）對異丙酚萃取率的影響。由表4可知，最佳萃取直徑為0.762 mm，平均萃取率為102.0%，RSD為4.07%。

2.1.4 蛋白沉淀劑的種類及用量。在保證蛋白質具有較好沉淀效果且降低對環境污染的情況下，用量應盡可能少。因此，考察甲醇用量（1.0 、2.0 、3.0 ml）對異丙酚萃取率的影響。結果表明，1.0 ml甲醇具有較好的萃取率。

2.2 方法學驗證

2.2.1 標準曲線。配制異丙酚標準品的甲醇溶液（2.5 μl/ml），得到光譜圖。由圖2可知，異丙酚最大發射波長位于285 nm。將異丙酚標準液與新鮮加肝素的SD大鼠全血混合，配制成濃度分別為0.05、0.25、0.50、1.25、2.50、5.00、10.00 μg/ml的樣品溶液，并按照“1.1”中的步驟測定其熒光強度。以異丙酚濃度為橫坐標，以熒光強度為縱坐標，得回歸方程Y=13.576X+10.112，r=0.995 8，線性范圍為0.05～10.0 μg/ ml（表5）。

2.2.2 精密度試驗。制備2.5 μg/ml異丙酚全血樣品，日內測定3次，RSD為1.43%。由此可知，該方法精密度良好。

2.2.3 回收率。向1.0 ml新鮮加肝素空白全血中加入50 μl 60 μg/ml異丙酚注射乳劑甲醇溶液，使本底樣品濃度為3.00 μg；分別加入0.5、2.5、5.0 μg異丙酚標準品溶液，并且按照“1.2”中的步驟測定其熒光強度。由表6可知，該方法的回收率良好。

2.3 與傳統液-液萃取方法的比較 由表7可知，該方法借助簡便的毛細管微反應器對異丙酚進行萃取，操作步驟簡單，萃取時間短，萃取率較高，為異丙酚生物樣品的在線前處理提供可能。

3 結論

異丙酚主要分布在全血中，血漿藥物濃度遠低于全血藥物濃度，因此選用全血作為分析測試對象。該研究建立了一種操作簡便、萃取時間短、樣品萃取率高的全血樣品前處理方法，通過毛細玻璃管萃取后再加入蛋白沉淀劑，靜置，直接取樣分析。但是，濃度10%三氯乙酸甲醇溶液、濃度6%高氯酸甲醇溶液能夠破壞紅細胞，使得測定結果不能正確反映萃取結果，所以沉淀劑選用甲醇。

參考文獻

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