抗番鴨細(xì)小病毒卵黃抗體的制備

趙瑞宏等

摘要[目的]有效預(yù)防和治療番鴨細(xì)小病毒病。[方法]用番鴨細(xì)小病毒連續(xù)免疫產(chǎn)蛋母雞3次，收集雞蛋，并制備出高免卵黃抗體。通過瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)對制備的卵黃抗體進(jìn)行效價測定，用雛番鴨進(jìn)行中和與治療試驗(yàn)。[結(jié)果]制備的卵黃抗體瓊擴(kuò)效價達(dá)到1∶32，能有效中和番鴨細(xì)小病毒對雛番鴨的致病性，對發(fā)病的雛番鴨有很好的治療作用。[結(jié)論]該研究為番鴨細(xì)小病毒的預(yù)防和治療提供了一種有效的生物制品。

關(guān)鍵詞番鴨細(xì)小病毒；卵黃抗體；制備

中圖分類號S858.32文獻(xiàn)標(biāo)識碼A文章編號0517-6611（2015）29-062-03

番鴨細(xì)小病毒（Muscovy duck parvovirus，MDPV）為細(xì)小病毒科、細(xì)小病毒屬的成員，病毒直徑20～24 nm，無囊膜，呈二十面體對稱，基因組大小約5 kb。主要引起1～3周齡雛番鴨發(fā)病，以腹瀉、軟腳、喘氣為特征，發(fā)病率為27%～62%，病死率為22%～43%，且病愈鴨大部分成為僵鴨。隨著安徽省番鴨養(yǎng)殖量的增加，番鴨細(xì)小病毒病也時有發(fā)生。研究表明，IgY是一種高效、特異的抗體，且方便、廉價。為了有效防治番鴨細(xì)小病毒病，筆者制備了抗番鴨細(xì)小病毒卵黃抗體，通過試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)其對番鴨細(xì)小病毒病起到了明顯的預(yù)防和治療作用。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

番鴨細(xì)小病毒AH株，由安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所分離、鑒定并保存。番鴨胚和雛番鴨，從非疫區(qū)購回番鴨種蛋，自行孵化。高產(chǎn)蛋雞為購自安徽省肥西縣某雞場飼養(yǎng)的200日齡、健康的京紅1號商品代蛋雞。營養(yǎng)瓊脂和血瓊脂培養(yǎng)基，均購自北京奧博星生物技術(shù)有限公司；氯仿、瓊脂糖、氯化鈉均為國產(chǎn)分析純。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1病毒培養(yǎng)。

將MDPV AH株病毒液經(jīng)尿囊腔接種12日齡番鴨胚，0.1 ml/胚，37 ℃下孵育，每天觀察2次至第5天，棄去24 h內(nèi)的死胚，收集24～120 h內(nèi)死亡的鴨胚尿囊液，置于-80 ℃冰箱中凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2病毒ELD50測定。

將病毒用生理鹽水進(jìn)行連續(xù)10倍系列稀釋，每個稀釋度接種4枚12日齡番鴨胚，0.1 ml/胚，37 ℃條件下孵化，棄去24 h內(nèi)的死胚，每天照蛋2次，連續(xù)觀察5 d，采用ReedMuench法計(jì)算ELD50。

1.2.3產(chǎn)蛋雞免疫。

取100只非免疫產(chǎn)蛋雞隔離飼養(yǎng)，用實(shí)驗(yàn)室保存的MDPV AH 株病毒液（ELD50為10-5.5/0.1 ml），每只雞胸肌注射 0.2 ml 進(jìn)行首免；14 d后進(jìn)行2次免疫，每只雞胸肌注射 0.5 ml；28 d進(jìn)行第3次免疫，每只雞胸肌注射 1.0 ml。三免后14 d收集雞蛋。免疫期間，統(tǒng)計(jì)免疫前后的產(chǎn)蛋率。

1.2.4高免卵黃抗體的制備與純化。

參照文獻(xiàn)

方法，取高免雞蛋洗凈并消毒，取出卵黃，收集卵黃液。將卵黃液用滅菌生理鹽水按1∶5的比例稀釋、混合、攪拌均勻，加入等體積的氯仿，充分振蕩后5 000 r/min 離心10 min，收集上層水相，置于-20 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.5無菌檢驗(yàn)。

分別取0.2 ml純化的卵黃抗體接種于營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基和血瓊脂培養(yǎng)基。將培養(yǎng)基置于37 ℃條件下培養(yǎng)觀察3～5 d。

1.2.6抗體安全性檢測。

取純化的卵黃抗體，分別經(jīng)肌肉注射和口服途徑接種3日齡雛番鴨各5只，接種劑量為1 ml/只，同時取5只3日齡雛番鴨接種生理鹽水作為對照。各組隔離飼養(yǎng)，觀察并記錄各組雛番鴨生產(chǎn)性能。

1.2.7瓊擴(kuò)抗原的制備。

取MDPV AH株胚胎尿囊液20 ml，5 000 r/min離心10 min，取上清分裝于7 ml玻璃瓶中，每瓶2 ml進(jìn)行凍干備用。

1.2.8瓊脂擴(kuò)散效價的測定。

稱取1 g瓊脂糖置于100 ml 8%NaCl 溶液中，加熱融化后倒入玻璃培養(yǎng)皿中制成瓊脂擴(kuò)散平板，冷卻后用打孔器打成梅花狀小孔，各孔用融化的瓊脂糖補(bǔ)底。置于 4 ℃下冷卻，取制備的凍干瓊擴(kuò)抗原1瓶，用200 μl超純水溶解，取 50 μl加入中間孔，外周孔依次加入倍比稀釋的純化卵黃抗體50 μl。將加樣后的瓊脂擴(kuò)散平板放入濕盒內(nèi)置37 ℃溫箱擴(kuò)散24～48 h。

1.2.9中和與治療試驗(yàn)。

將30只3日齡雛番鴨隨機(jī)分成3組，每組10只。取純化的卵黃抗體1 ml與等量病毒液（ELD50為10-5.5/0.1 ml）混勻，37 ℃下作用1 h，肌肉注射第1組雛番鴨，0.2 ml/只；取生理鹽水與等量病毒液混勻，37 ℃下作用1 h，肌肉注射第2組和第3組雛番鴨，0.2 ml/只；第3組雛番鴨在接毒后 96 h每只皮下注射純化的卵黃抗體0.5 ml。各組分開隔離飼養(yǎng)觀察10 d，記錄各組發(fā)病和死亡情況。

2結(jié)果與分析

2.1病毒的培養(yǎng)

12日齡番鴨胚經(jīng)尿囊腔接種MDPV AH株病毒液后于86～96 h死亡，死亡胚胎尿囊液澄清透明。

2.2病毒的ELD50

病毒進(jìn)行連續(xù)10倍系列稀釋后接種番鴨胚，5 d內(nèi)番鴨胚死亡情況見表1。

采用ReedMuench法，d=（80-50）/（80-20）=0.5，ELD50的對數(shù)為-5+0.5×（-1）=-5.5，ELD50=10-5.5/01 ml。

2.3產(chǎn)蛋雞免疫

100只產(chǎn)蛋母雞接種后采食、產(chǎn)蛋正常，沒有不良反應(yīng)。

2.4無菌檢驗(yàn)結(jié)果

接種卵黃抗體的營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基和血瓊脂培養(yǎng)基經(jīng)37 ℃培養(yǎng)5 d，取出觀察發(fā)現(xiàn)無細(xì)菌生長。

2.5抗體安全性檢測結(jié)果

3日齡雛番鴨經(jīng)肌肉注射和口服途徑接種的試驗(yàn)組和接種生理鹽水的對照組雛番鴨的生產(chǎn)性能無明顯差異。

2.6瓊脂擴(kuò)散效價的測定

24 h后取出瓊脂擴(kuò)散平板觀察，在抗原抗體孔之間有明顯沉淀線，抗體效價達(dá)1∶32。

2.7中和與治療試驗(yàn)

由表2可知，第1組接種卵黃抗體與病毒混合液的雛番鴨，未出現(xiàn)發(fā)病癥狀和死亡；第2組在接種后第4天出現(xiàn)發(fā)病癥狀，第5天死亡1只，至第9天接種的10只全部死亡；第3組在接毒后第4天出現(xiàn)發(fā)病癥狀，注射卵黃抗體后第2天死亡1只，其余9只恢復(fù)正常。

3小結(jié)與討論

（1）筆者成功制備出抗番鴨細(xì)小病毒卵黃抗體，卵黃抗體瓊脂擴(kuò)散效價達(dá)1∶32，對發(fā)病的雛番鴨有明顯的治療作用，能有效中和番鴨細(xì)小病毒。

（2）番鴨細(xì)小病毒病與其他細(xì)小病毒一樣以體液免疫為主，通過母源抗體可使雛番鴨獲得被動保護(hù)，規(guī)模化番鴨場種鴨使用MDPV疫苗，其子代雛番鴨可獲得母源抗體的保護(hù)而不發(fā)病，但一些養(yǎng)鴨場常出現(xiàn)疫苗免疫效果不甚理想或免疫失敗現(xiàn)象，用卵黃抗體可進(jìn)行有效預(yù)防和治療，為番鴨細(xì)小病毒病的預(yù)防和治療提供了一種新藥物。

（3）在瓊脂擴(kuò)散抗原的制備過程中，采用凍干的方法進(jìn)行10倍濃縮，濃縮的抗原與抗體能特異性結(jié)合形成沉淀線，凍干的抗原也易于保存。

（4）在病毒培養(yǎng)和ELD50測定時，番鴨胚在接種MDPV AH株病毒液后86～96 h即發(fā)生死亡，說明分離毒株的毒力強(qiáng)。

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