病毒滅活冷沉淀的外用研究進展

馮秋斌 王艷紅 趙蘇丹 劉占彥 李會來 趙琦 張娜

冷沉淀(Cryo)每袋由200 ml 血漿制成。在100 ml新鮮冰凍血漿制備的冷沉淀中，F(xiàn)Ⅷ因子的含量應(yīng)≥40 U，F(xiàn)g 的含量應(yīng)≥75 mg［7］。為了保障冷沉淀的質(zhì)量，血站通常對血漿不做病毒滅活處理直接制作出冷沉淀或僅濾除白細(xì)胞制作成去白細(xì)胞冷沉淀凝血因子。由于輸血可以引起血源性疾病的傳播和同種免疫反應(yīng)［8，9］，對于所有的血液制劑來說風(fēng)險較高的是輸注冷沉淀，更容易使病毒傳染［10］。在1 ～5℃溫度下新鮮的冰凍血漿產(chǎn)生的白色沉淀物就是冷沉淀，具有不溶解的特性，直到37℃的時候才會溶化，其主要成分是Ⅶ因子、Ⅻ因子、纖維蛋白原以及纖維結(jié)合蛋白等。冷沉淀最早是用來治療血友病的，因為其中有大量的Ⅷ因子，這也正是對治療效果帶來影響的主要因素。當(dāng)前新鮮的冰凍血漿和普通的冷凍血漿以及冷沉淀凝血因子是臨床中應(yīng)用最為廣泛的血漿制品。其中新鮮的冰凍血漿中除了含有正常人的血漿蛋白之外還具有全部凝血因子，非常適合出血性疾病患者以及輸血期間出現(xiàn)凝血障礙的患者。但是如果血液供應(yīng)者當(dāng)前正處于病毒感染的窗口期，沒能夠及時檢測病毒的存在，則可能導(dǎo)致受血者感染病毒。當(dāng)前國內(nèi)常用的病毒滅活技術(shù)能夠有效的預(yù)防由于輸血或者是血液制品造成的傳染性疾病，降低輸血帶來的風(fēng)險，在各類疾病的治療中發(fā)揮出巨大的作用。但是作為一種新型的血液制品，冷沉淀凝血因子的治療標(biāo)準(zhǔn)仍處于討論當(dāng)中，進行進一步的研究探討對于提高冷沉淀的臨床應(yīng)用質(zhì)量非常關(guān)鍵。

1 冷沉淀的作用機制

冷沉淀是由五種主要成分組成的，分別是FⅧ、Fg、纖維結(jié)合蛋白以及vWF，其中FⅧ是一種大分子復(fù)合物，又叫做抗血友病球蛋白，通過加快FX 活化速度來幫助血小板盡快聚集，這樣一來內(nèi)源性凝血活酶的形成速度就會加快，對于內(nèi)源凝血系統(tǒng)的激活有促進作用。粘性糖蛋白Fn 不僅可以有效的抑菌、抗感染并且調(diào)控免疫力，同時還可以對纖維蛋白的交聯(lián)、細(xì)胞粘著，可以有效的修復(fù)和分化。Fg 含量的增加增強了血小板的聚集功能以及凝血途徑的速度。相比起FFP來說冷沉淀中Fg、FⅫ以及FⅧ的活性都有大量的增加。冷沉淀含有多種成分，其主要成分的作用機制見表1。

2 冷沉淀的制備

手工制作冷沉淀的傳統(tǒng)方法如下:將血液采集后在6小時以內(nèi)將其制備為新鮮的冰凍血漿也就是FFP，然后用4℃的水輕輕搖動血漿將FFP 溶化，在還有60 ml冰渣的時候?qū)⑵淙〕霾⑦M行15 min 的離心，并且將血漿在無菌條件下進行移除，余下的未能溶解的白色膠狀物約有20 ml 左右，將其凍存在冰箱內(nèi)并保持零下30℃的溫度就可以形成冷沉淀。通過研究可以看出冷沉淀中的含有的凝血因子會受到血型、儲藏時間這兩個因素的影響，冷沉淀在融化以后FⅧ的活性就隨之儲藏時間而不斷降低［11］。

表1 冷沉淀成份及作用機制

3 冷沉淀的病毒滅活

使用病毒滅活有機溶劑法(SD)來進行冷沉淀的病毒滅活，可以將病毒滅活的性能有效的提高，同時Fg、FⅧ以及vWF 的活性都可以得到提高。具體的方法是加入2%的磷酸三丁酯(TnBP)在冷沉淀中，置于37℃下4 h，或者加入1%的TnBP 和1%的Triton X-45也可以達到效果。冷沉淀中的FⅧ、vWF 以及具有凝血活性的Fg 在經(jīng)過這個辦法的滅活之后平均回收率可以達到93%以上。

4 治療方法

4.1 用于HA 的治療 HA 又名抗血友病球蛋白缺乏癥，輕型的成人以及兒童HA 出血都可以使用冷沉淀來進行預(yù)防和治療。約有一半的冷沉淀在臨床上用于胸外科手術(shù)以及心血管手術(shù)［12］，血友病患者在進行外科手術(shù)的時候的出血可以使用冷沉淀來進行預(yù)防和治療并且療效顯著。應(yīng)用冷沉淀的頻率保持在2 ～3 周/次，劑量為2 U/10 kg，但發(fā)現(xiàn)有大量的出血跡象或者需要輸血的時候可以使用10 ～20 U/次的冷沉淀進行輸注，同時進行一定量的血小板以及抗凝血酶制劑的補充。但是冷沉淀長期使用會產(chǎn)生FCⅢ:C 抗體，對治療效果不利。很多發(fā)展中國家目前仍然首選冷沉淀來進行FⅧ缺乏的治療，但是發(fā)達國家中得到最廣泛應(yīng)用的是FⅧ濃縮物，由于其價格昂貴所以無法在發(fā)展中國家得到廣泛的應(yīng)用，但這是目前對血友病患者進行治療的主要發(fā)展方向。

4.2 用于vWD 的治療 vWD 的臨床表現(xiàn)是出血以及出血時間長，是由于vWF 的缺乏或者異常而導(dǎo)致的。如果對vWD 出血患者使用其他的濃縮劑治療無效的時候就適用冷沉淀。原始的血漿中約有一半的vWF 會在制備過程中被保留在冷沉淀中，使用的劑量為1 U/10 kg 體重，所以使用冷沉淀治療一些比較特殊的vWD 患者是可行的，F(xiàn)Ⅷ濃縮物在經(jīng)過了病毒滅活之后也可以用來對vWD 進行治療，因為其中的vWF含量豐富。

4.3 用于Fg 癥的治療 Fg 缺乏有兩種，分別是遺傳性Fg 缺乏癥和獲得性Fg 缺乏癥，對于后者來說標(biāo)準(zhǔn)的治療方法就是使用冷沉淀來進行治療。冷沉淀主要是用于對預(yù)防具有出血傾向的患者以及治療低Fg 血癥性出血，是替代Fg 濃縮制劑而存在的，使用的劑量由眾多因素共同決定，例如患者的Fg 水平、血容量、出血是否嚴(yán)重以及所使用的冷沉淀的質(zhì)量等，F(xiàn)g 在輸注了冷沉淀之后可以提高至1.0 g/L。以下三種情況的患者適用冷沉淀進行治療，一是患者的Fg 水平低于1.0 g/L 并且微血管出血情況嚴(yán)重，具有外傷和擬進行侵入性操作;二是患者由于微血管內(nèi)出血嚴(yán)重需要大量輸血，但是其Fg 水平無法及時進行測量的情況;三是患者先天缺乏Fg(1.0 g/L ＜Fg ＜1.5 g/L)并且有潛在的出血危險，或者患者存在進行性出血的情況。單獨缺乏Fg 的情況很少，尤其是成人因此出血的情況就更少了，最常見的Fg 缺乏就是DIC，如果患者低Fg血癥嚴(yán)重并且并發(fā)DIC，那么FFP 的單獨應(yīng)用量對于Fg 的提升無法超過1.0 g/L，但是進行冷沉淀輸入則可以將Fg 水平至少提高到0.75 g/L。輸入冷沉淀適應(yīng)證會在DIC 得到緩解之后消失。

4.4 對Fn 進行補充 如果創(chuàng)傷或者感染情況嚴(yán)重會大量的消耗Fn，在輸入冷沉淀之后30 min 可以明顯的提升Fn 含量，這種高水平一直可以持續(xù)2 h。冷沉淀應(yīng)用最有效的情況是粘膜病變的時候，吞噬細(xì)胞會在高濃度Fn 的促進下不斷提高其吞噬作用，起到傷口凈化的作用［13，14］，并且通過間質(zhì)作用將細(xì)胞間的結(jié)合進行了加固。當(dāng)人體患上了白血病以及一些惡性腫瘤之后，體內(nèi)的Fg 和Fn 降低情況明顯，在腫瘤切除過程中輸入冷沉淀不僅可以止血和預(yù)防感染，同時可以抑制癌細(xì)胞的擴散。

4.5 對凝血功能障礙進行糾正 換上了凝血功能障礙的患者在進行大手術(shù)的時候需要大量的數(shù)學(xué)，但是如果只選用庫存血輸入的話不僅沒有止血效果，而且會消耗或者稀釋凝血因子，擾亂凝血功能。應(yīng)該將FFP、冷沉淀和血小板進行配比混合然后輸入［15］，對于凝血功能異常有良好的糾正作用。

4.6 冷沉淀治療感染的作用機制 補充內(nèi)源性凝血因子，糾正凝血功能紊亂［16］;穩(wěn)定紅細(xì)胞膜，加強其在體內(nèi)的免疫功能;促進單核巨噬細(xì)胞的吞噬功能;補充和調(diào)節(jié)Slit2 蛋白分泌，穩(wěn)定溶酶體膜;穩(wěn)定內(nèi)環(huán)境。

4.7 惡性腫瘤與冷沉淀 惡性腫瘤患者凝血功能紊亂，常處于高凝狀態(tài)，易形成靜脈血栓、動脈血栓和血栓性靜脈炎;高凝狀態(tài)促進腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移，與患者的預(yù)后有著密切關(guān)系:大量組織因子活化了凝血途徑;纖維蛋白原的分解及纖溶系統(tǒng)受到抑制;抑制凝血途徑激活、降低纖維蛋白原濃度是治療腫瘤患者的重要措施;預(yù)防性使用抗凝藥物可以明顯改善預(yù)后;冷沉淀含有大量的纖維蛋白原及其他凝血因子，激活凝血功能，處于高凝狀態(tài)的惡性腫瘤患者應(yīng)慎用;當(dāng)腫瘤患者發(fā)生大出血時，應(yīng)根據(jù)凝血功能檢測結(jié)果補充凝血因子，用量宜偏小，止血即停用。

4.8 冷沉淀中的Slit 蛋白 冷沉淀是人體血漿中的精華，含有Ⅰ、Ⅷ、す、vWF 以及Slit 蛋白、纖維結(jié)合蛋白等;是濃縮的凝血因子，主要用于大出血、DIC 出血期及低凝期，還用于抗感染治療，治療劑量8 ～12 U/次，必要時連續(xù)應(yīng)用。冷沉淀中的Slit 蛋白是一種分泌型糖蛋白，由1 個N-端信號肽、4 個富含亮氨酸的重復(fù)序列(LRRs)、9 個EGF 樣重復(fù)序列和1 個C-端的半胱氨酸結(jié)合而成。受體Robo 胞外區(qū)是由5 個Ig 樣功能區(qū)和3 個FN 樣結(jié)構(gòu)域組成，胞內(nèi)區(qū)由4 個CC 基序組成。

5 在臨床外用方面冷沉淀的新進展

5.1 深度燒傷 基底細(xì)胞會由于二度燒傷而受到損傷，例如汗腺等恢復(fù)過程十分緩慢。使用冷沉淀噴灑在創(chuàng)面可以將修復(fù)時間大幅縮短，因為冷沉淀中富含的纖維結(jié)合蛋白可以有效的促進創(chuàng)傷愈合，同時還有防止感染以及幫助創(chuàng)傷組織盡快修復(fù)的作用［17］。

5.2 皮膚和黏膜疾病 在黏膜發(fā)生病變的時候，病區(qū)周圍的上皮細(xì)胞的Fn 分泌會停止或者受到破壞，而冷沉淀中富含F(xiàn)n，可以形成一個堅固的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)來對細(xì)胞表面進行保護，同時控制炎癥、維持滲透壓并且修復(fù)創(chuàng)口［18］。同時使用冷沉淀治療外陰白斑這種常見的婦科疾病療效顯著，并且治療方法非常簡單，局部封閉配合外敷即可［19］。

5.3 角膜疾病 病毒性角膜炎、淚液減少癥、眼外傷、角膜燒傷、單獨性角膜上皮糜爛以及單純皰疹病毒性角膜炎都可以使用冷沉淀制備的眼藥水進行治療，可以消除充血情況、對損傷進行修復(fù)，并且可以起到修復(fù)視力的作用［14］。

6 最新動態(tài)

冷沉淀在臨床外用方面有著其他藥劑不可比擬的獨到之處，無論局部注入、局部噴灑或點滴、口服、促進創(chuàng)面愈合及治療皮膚、黏膜疾病、角膜疾病等療效都非常顯著，況且來源容易、使用簡單［20］，但是冷沉淀作為一種特殊的血液制劑也可能引起血源性疾病的傳播，而一旦傳播極有可能造成多人次爆發(fā)感染。國內(nèi)文獻關(guān)于冷沉淀的應(yīng)用研究報道較多，但鮮有研究指明用的冷沉淀經(jīng)過病毒滅活。故此在制作外用冷沉淀時除了嚴(yán)把血源檢測外更應(yīng)該進行血漿病毒滅活，病毒滅活后的冷沉淀對其外用有更加實際的臨床意義。

總而言之，基于輸血安全性以及降低傳播病毒風(fēng)險的角度來看，病毒滅活冷沉淀非常必要。盡管我國當(dāng)前輸血安全性得到顯著提高，但是受技術(shù)條件的制約，病毒的窗口期等因素難以完全排除，同時可能出現(xiàn)過敏性休克等難以預(yù)測的輸血不良反應(yīng)，對輸血質(zhì)量造成較大的影響。臨床研究中有部分患者輸注冷沉淀的過程中可能出現(xiàn)變態(tài)反應(yīng)，盡管患者的癥狀較輕，也應(yīng)當(dāng)及時停止應(yīng)用，改用凝血酶或者是其他血液制品。且有大量的研究資料顯示，對危重患者應(yīng)用冷沉淀凝血因子，其心臟、肺部和肝腎等器官功能均得到一定的改善，對于臨床患者的救治具有重要意義。在今后的工作中還應(yīng)當(dāng)進一步探討病毒滅活冷沉淀在臨床中的應(yīng)用情況，拓寬其應(yīng)用渠道、減少不良事件的發(fā)生，產(chǎn)生更大的效益。

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