原發(fā)性無精癥及少精癥患者遺傳學(xué)病因分析*

謝婷婷，王世君

(1.貴州醫(yī)科大學(xué) 臨床檢驗(yàn)學(xué)教研室，貴州 貴陽 550004;2.貴州醫(yī)科大學(xué)附院 臨檢科，貴州 貴陽 550004)

不孕不育影響著全球大約10%～15%的育齡夫婦，其中近50%歸因于男性［1］。導(dǎo)致男性不育的因素排除精索靜脈曲張、輸精管阻塞、激素水平失衡及感染等因素外，遺傳因素引起的生精障礙是導(dǎo)致男性不育的重要原因，表現(xiàn)為原發(fā)性無精子癥或少精子癥［2］，遺傳因素包括基因突變和染色體異常，本研究對原發(fā)性無精子癥或少精子癥患者外周血染色體核型和Y 染色體微缺失進(jìn)行篩查，以了解生精障礙與染色體異常和Y 染色體微缺失的關(guān)系。

1 對象與方法

1.1 研究對象

原發(fā)性無精子癥或少精子癥患者87 例，45 例為實(shí)驗(yàn)1 組，進(jìn)行外周血染色體核型分析，平均(32.1±6.0)歲，其中無精子癥23 例，少精子癥22例，嚴(yán)重少精子癥10 例;42 例為實(shí)驗(yàn)2 組，進(jìn)行Y染色體微缺失篩查，平均(32.5±5.0)歲，其中無精子癥9 例，少精子癥33 例，嚴(yán)重少精子癥14 例。精液常規(guī)正常男性對照50 例為對照1 組，平均(31.1±3.1 歲);40 例為對照2 組，平均(29.5±5.5)歲。原發(fā)性無精子癥、少精子癥納入標(biāo)準(zhǔn):參照WHO 標(biāo)準(zhǔn)，連續(xù)3 次精液常規(guī)檢查，離心后沉淀物中均未發(fā)現(xiàn)精子者為無精子癥，精子密度＜20×109/L 為少精子癥，精子密度＜5×109/L 為嚴(yán)重少精子癥。

1.2 方法

外周血染色體核型分析:培養(yǎng)外周血淋巴細(xì)胞、制備染色體標(biāo)本并進(jìn)行Giemsa 染色，每例標(biāo)本計(jì)數(shù)15 ～20 個(gè)核型，分析4 ～5 個(gè)核型，異常核型加倍計(jì)數(shù)分析。Y 染色體微缺失篩查:應(yīng)用多重PCR－凝膠電泳技術(shù)，酚－氯仿法提取外周血有核細(xì)胞基因組DNA，紫外分光光度計(jì)鑒定DNA 含量及純度。參照參考文獻(xiàn)［3］設(shè)計(jì)A、B 兩組共7 對基因(STS 片段)引物序列，見表1。建立四重PCR反應(yīng)體系，瓊脂糖凝膠電泳分析PCR 產(chǎn)物。以sY14(SRY)為內(nèi)對照;正常男性DNA 擴(kuò)增產(chǎn)物為陽性對照，正常女性DNA 擴(kuò)增產(chǎn)物為陰性對照。多重PCR 檢出位點(diǎn)缺失者，再次行單一PCR-瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證，二者均檢出缺失則判定該位點(diǎn)缺失。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)采用SPSS 18.0 統(tǒng)計(jì)軟件分析，計(jì)量資料比較采用χ2檢驗(yàn)，P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表1 PCR 引物序列及擴(kuò)增片段長度Tab.1 Sequences and product length of primers in PCR

2 結(jié)果

2.1 外周血染色體核型

實(shí)驗(yàn)1 組患者中，染色體核型異常17 例(37.8%)，其中23 例無精子癥患者中有13 例(56.5%)，22 例少精子癥患者中有4 例(18.2%)。對照1 組中發(fā)現(xiàn)染色體核型異常8 例(16.0%)。實(shí)驗(yàn)1 組染色體異常檢出率顯著高于對照1 組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.05)，見表2。

2.2 Y 染色體微缺失

實(shí)驗(yàn)2 組患者中，5 例(11.9%)有Y 染色體STS 位點(diǎn)的缺失;對照2 組無Y 染色體STS 位點(diǎn)的缺失，見表3。對5 例有Y 染色體STS 位點(diǎn)缺失的患者(標(biāo)本原始編號為12、44、65、66 及75)進(jìn)行外周血染色體核型分析發(fā)現(xiàn)，5 例患者中，缺失片段均有SY254、SY255(DNA 2)，兩例合并其他缺失，3例發(fā)現(xiàn)染色體核型異常，見表4。

3 討論

染色體核型異常是導(dǎo)致男性生精障礙的重要原因之一，有研究報(bào)道，無精癥患者染色體核型異常檢出率為2.1%～58%［4］。本次調(diào)查顯示，45 例原發(fā)性無精子癥、少精子癥患者中，染色體核型異常檢出率(37.8%)明顯高于精液常規(guī)正常男性(P ＜0.05);特別是在23 例無精子癥患者中，染色體核型異常檢出率高達(dá)56.5%，進(jìn)一步證明隨著生精障礙的加重，染色體核型異常率升高。克氏綜合征染色體核型為三體型47，XXY 或嵌合型46，XY/47，XXY，是男性不育患者中最常見的染色體異常，占男性無精子癥的10%以上［5］。患者表現(xiàn)為體高，睪丸小而硬，曲細(xì)精管玻璃樣變性，往往無生育能力。本次調(diào)查顯示，23 例無精癥患者中3例(13.0%)染色體核型為47，XXY 或嵌合型46，XY/47，XXY，而少精子癥患者和精液常規(guī)正常男性對照未查見克氏征核型，提示克氏征與精子發(fā)生障礙密切相關(guān)。關(guān)于大Y 染色體與精子發(fā)生關(guān)系的研究報(bào)道較少，部分報(bào)道認(rèn)為Yq 異染色質(zhì)DNA過多的重復(fù)可能干擾相鄰常染色質(zhì)區(qū)精子發(fā)生相關(guān)基因功能的正常發(fā)揮或減數(shù)分裂，從而導(dǎo)致精子生成障礙［6］。本次調(diào)查顯示，45 例原發(fā)性無精子癥、少精子癥患者與精液常規(guī)正常男性比較;差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，這可能與本次研究的檢測例數(shù)較少或選擇標(biāo)準(zhǔn)不同有關(guān)。

表2 異常染色體核型及檢出率Tab.2 Detection rate of chromosome abnormalities

表3 多重PCR-凝膠電泳技術(shù)檢測Y 染色體微缺失Tab.3 Y chromosome microdeletions detected by multiplex PCR-gel electrophoresis

表4 Y 染色體微缺失患者染色體核型Tab.4 Chromosome aberrations of patients with Y chromosome microdeletions

1976 年，Tiepolo 等［7］推測Y 染色體上存在控制精子生成的基因－無精子癥因子(azoospermia factor，AZF)。目前，已發(fā)現(xiàn)Yq 第5、6 間隔區(qū)內(nèi)至少存在AZFa、AZFb、AZFc 和AZFd 4 個(gè)互不重疊的區(qū)域與精子發(fā)生有關(guān)［8］，各區(qū)域內(nèi)又包括若干AZF 候選基因，如DBY、DFFRY/USP9Y(AZFa);RBMY1(AZFb);DAZ(AZFc)等，它們的突變或缺失可能引起精子發(fā)生異常。AZF 因片段較小，僅可通過PCR 對AZF 區(qū)域STSs 進(jìn)行檢測，不同報(bào)道的Y 染色體微缺失率相差很大，從1%～55%不等，但大部分研究顯示該缺失率低于15%［9］。本次調(diào)查顯示，對照均無AZF 微缺失，無精癥、少精癥患者中，有5 例(11.9%)檢出有AZF 微缺失，其中，14 例嚴(yán)重少精癥患者中2 例(14.3%)有AZF 微缺失;9 例無精癥患者中3 例(33.3%)有AZF 微缺失，提示AZFc/DAZ 區(qū)為微缺失篩查的熱點(diǎn)，AZF 微缺失檢測對無精癥、少精癥的診治具有重要指導(dǎo)意義。本研究中有Y染色體微缺失的患者中3 例發(fā)現(xiàn)Y 染色體數(shù)目或結(jié)構(gòu)異常，提示Y 染色體微缺失和染色體核型異常可同時(shí)發(fā)生，對生精障礙患者應(yīng)同時(shí)進(jìn)行這兩種檢查。

綜上所述，染色體核型異常和Y 染色體微缺失可能是導(dǎo)致男性生精障礙的重要原因，對男性不育患者進(jìn)行染色體核型分析和Y 染色體微缺失篩查具有重要的臨床意義。

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