百令膠囊對糖尿病腎病患者單核細(xì)胞Toll 樣受體4 表達(dá)及炎性因子的影響

劉春燕 陳云霞 蘇俊平 劉欣榮 朱春景

糖尿病腎病(DN)作為糖尿病(DM)最常見的微血管并發(fā)癥，已成為全球終末期腎病的首要病因。DN既可表現(xiàn)為腎小球的病理改變，又可表現(xiàn)為腎間質(zhì)及腎盂改變。其中最常見的是腎小球硬化癥，是DM 全身微血管病變在腎臟的表現(xiàn)。研究發(fā)現(xiàn)炎性因子及促炎性因子與DN 的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，并認(rèn)為DN 是一種炎癥性疾病［1］。Toll 樣受體4(TLR4)是跨膜信號轉(zhuǎn)導(dǎo)受體家族TLRs 的重要成員，能夠特異性結(jié)合細(xì)菌脂多糖等多種病原分子啟動一系列信號級聯(lián)反應(yīng)，促進(jìn)hs-CRP、TNF-α 等炎性因子釋放，從而介導(dǎo)天然免疫防御過程。百令膠囊具有提高細(xì)胞免疫力、改善循環(huán)、抑制氧化應(yīng)激等功能。本研究通過比較治療前后糖尿病腎病患者外周血單個核細(xì)胞TLR4 表達(dá)及血清炎癥因子水平變化，旨在探討百令膠囊對DN 患腎功能的保護(hù)作用。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2014 年1 月至2015 年1 月滄州市人民醫(yī)院門診及住院的T1DM 或T2DM 的DN 患者60 例，其中男37 例，女23 例;年齡43 ～57 歲，平均(50.92 ±8.13)歲。同期于我院進(jìn)行健康體檢的正常人50 例為對照組，其中男26 例，女24 例;年齡40 ～59歲，平均(52.14 ±8.86)歲。60 例患者隨機(jī)分為治療A 組(n =28)和治療B 組(n =32)，2 組患者性別比、年齡、病程、體重等基礎(chǔ)資料比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P ＞0.05)，具有可比性。見表1。

表1 2 組一般資料比較 ± s

表1 2 組一般資料比較 ± s

組別 治療A 組(n =28) 治療B 組(n =32)51.24 ±7.32 50.67 ±7.41性別(例，男/女) 17/11 20/12病程(年) 6.13 ±0.92 6.24 ±1.02使用胰島素劑量(U/d) 39.52 ±5.67 41.12 ±5.72收縮壓(mm Hg) 137.04 ±12.69 139.69 ±15.17舒張壓(mm Hg) 80.04 ±12.69 82.69 ±15.17血肌酐(μmol/L) 97.44 ±9.69 98.32 ±10.54 24 h 尿蛋白(g/L) 2.56 ±0.28 2.67 ±0.25空腹血糖(mmol/L) 13.79 ±2.06 14.01 ±2.04 HbA1c(%)年齡(歲)11.99 ±1.80 12.18 ±1.79

1.2 納入標(biāo)準(zhǔn) (1)符合2010 年美國糖尿病協(xié)會制定的糖尿病診斷標(biāo)準(zhǔn)［2］，且根據(jù)Mogensen DN 診斷與分期標(biāo)準(zhǔn)均為DNⅢ～Ⅳ期;(2)24 h 尿蛋白排泄率＞300 mg，且連續(xù)2 次以上;(3)GFR ＞60 ml/min;(4)近期血糖控制穩(wěn)定;(5)終末期血肌酸酐＜265 μmol/L;(6)患者簽署知情同意書。

1.3 排除標(biāo)準(zhǔn) (1)既往腎臟病史者或近期服用過腎毒性藥物者;(2)合并有其他腎臟疾病和DM 以外的腎臟損害者;(3)嚴(yán)重感染或心、肝、肺、腎等重要臟器功能不全者;(4)惡性腫瘤患者;(5)精神疾病患者;(6)妊娠及哺乳期女性。

1.4 治療方法 2 組均給予糖尿病常規(guī)治療，包括健康宣教、飲食控制、適當(dāng)運動、降糖、降脂等對癥措施，并給予優(yōu)質(zhì)低蛋白飲食。治療A 組在常規(guī)治療的同時應(yīng)用厄貝沙坦(150 mg/d，口服，浙江華海藥業(yè))，治療B 組在治療A 組基礎(chǔ)上聯(lián)合應(yīng)用百令膠囊(3.0 g/次，3/d，口服，杭州中美華東制藥有限公司)。療程均為12 周。

1.5 觀察指標(biāo) 分別在治療前后抽取患者清晨空腹靜脈血2 ml，不抗凝，37℃恒溫箱凝結(jié)至少30 min，血標(biāo)本凝固后，3 000 r/min，4℃、離心10 min，分離血清，－70℃保存?zhèn)錅y。采用Real time-PCR 和Western blot測定外周血單個核細(xì)胞TLR4 mRNA 和蛋白表達(dá)。采用酶聯(lián)免疫吸附實驗(ELISA)測定血清MCP-1、hs-CRP、TNF-α、IL-6、IL-18 水平。所有患者檢查前1 d 清淡飲食，以便胃排空，晚餐后禁食≥12 h，檢查當(dāng)日清晨抽肘靜脈血。

1.6 檢測方法

1.6.1 Real time-PCR:根據(jù)GeneBank 中人TLR4 mRNA 序列，采用DNAMAN 軟件設(shè)計引物，引物序列見表2，由日本Takara 生物技術(shù)有限公司合成。Trizol 提取外周血單個核細(xì)胞總RNA，紫外分光光度計測定RNA 的純度和濃度。以總RNA 為模板，按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進(jìn)行操作，合成cDNA 第1 鏈。PCR 反應(yīng)在ABI 7300 型實時熒光定量PCR 儀上進(jìn)行，擴(kuò)增完畢后進(jìn)入儀器自帶的SDS v1.3 軟件結(jié)果分析界面，使用SPSS10.0 統(tǒng)計計算樣品間Ct 值。設(shè)對照組樣品為標(biāo)準(zhǔn)1，目的基因mRNA 相對表達(dá)水平為2-△△Ct，設(shè)β-actin 為內(nèi)參照基因。見表2。

表2 Real time－PCR 引物序列及擴(kuò)增產(chǎn)物長度

1.6.2 Western blot:外周血單個核細(xì)胞加入RIPA 裂解液200 μl，冰上放置30 min 充分裂解細(xì)胞。提取細(xì)胞總蛋白，BCA 法定量蛋白，每組取100 μg 總蛋白進(jìn)行10% SDSPAGE 電泳，將目的蛋白電轉(zhuǎn)移至PVDF膜，10%脫脂奶粉室溫震蕩封閉2 h。加入特異性一抗孵育過夜，洗膜后加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠IgG，ECL 化學(xué)發(fā)光法顯色、定影。

1.6.3 ELISA 法:采用ELISA 法測定血清MCP-1、hs-CRP、TNF-α、IL-6、IL-18 水平，試劑盒購自武漢博士德生物工程有限公司。嚴(yán)格按照試劑盒說明書操作。960 酶標(biāo)儀購自美國Sigma 公司。

1.7 統(tǒng)計學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 13.0 統(tǒng)計軟件，計量資料以±s 表示，組內(nèi)治療前后比較采用配對t 檢驗，組間比較采用獨立樣本t 檢驗，P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 對照組和DN 組外周血單個核細(xì)胞TLR4 mRNA和蛋白表達(dá)比較 與對照組比較，DN 組外周血單個核細(xì)胞TLR4 mRNA 和蛋白表達(dá)均顯著增高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P ＜0.05)。見表3。

表3 對照組和糖尿病腎病組外周血單個核細(xì)胞TLR4 mRNA 和蛋白表達(dá)比較 ± s

表3 對照組和糖尿病腎病組外周血單個核細(xì)胞TLR4 mRNA 和蛋白表達(dá)比較 ± s

注:與對照組比較，* P ＜0.05

組別 TLR4 mRNA 相對表達(dá)水平 TLR4蛋白相對表達(dá)水平對照組(n =50)0.98 ±0.12 0.79 ±0.11 DN 組(n =60) 4.77 ±0.68* 4.57 ±0.72*

2.2 對照組和DN 組血清炎性因子水平比較 與對照組比較，DN 組血清MCP-1、hs-CRP、TNF-α、IL-6、IL-18 水平顯著升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P ＜0.05)。見表4。

表4 對照組和糖尿病腎病組血清炎性因子水平比較 ± s

表4 對照組和糖尿病腎病組血清炎性因子水平比較 ± s

注:與對照組比較，* P ＜0.05

組別 MCP-1(μg/L) hs-CRP(mg/L) TNF-α(ng/L) IL-6(ng/L) IL-18(ng/L)對照組(n =50) 23.56 ±3.44 1.12 ±0.14 6.32 ±0.57 18.87 ±2.76 2 1.42 ±3.25 DN 組(n =60) 278.35 ±34.47* 20.02 ±2.78* 20.33 ±3.25* 124.42 ±19.34* 108.36 ±14.51*

2.3 治療后TLR4 mRNA 和蛋白表達(dá)比較 治療前治療A 組和治療B 組TLR4 mRNA 和蛋白表達(dá)比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P ＞0.05);治療B 組治療后TLR4 mRNA 和蛋白表達(dá)較治療前顯著降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P ＜0.05);且治療B 組治療后TLR4 mRNA 和蛋白與治療A 組治療后比較顯著降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P ＜0.05)。治療A 組治療前后TLR4 mRNA 和蛋白比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P ＞0.05)。見表5。

2.4 治療后炎性因子水平比較 治療前治療A 組和治療B 組MCP-1、hs-CRP、TNF-α、IL-6、IL-18 水平比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P ＞0.05);治療B 組治療后MCP-1、hs-CRP、TNF-α、IL-6、IL-18 水平較治療前顯著降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P ＜0.05);且治療B 組治療后MCP-1、hs-CRP、TNF-α、IL-6、IL-18 水平與治療A組治療后比較顯著降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P ＜0.05)。治療A 組治療前后MCP-1、hs-CRP、TNF-α、IL-6、IL-18 水平比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P ＞0.05)。見表6。

表5 治療后TLR4 mRNA 和蛋白表達(dá)比較 ± s

表5 治療后TLR4 mRNA 和蛋白表達(dá)比較 ± s

注:與治療前比較，* P ＜0.05;與治療A 組比較，#P ＜0.05

組別 TLR4 mRNA 相對表達(dá)水平 TLR4蛋白相對表達(dá)水平治療A 組(n =28)治療前 4.72 ±0.65 4.60 ±0.65治療后 4.69 ±0.71 4.56 ±0.70治療B 組(n =32)治療前 4.80 ±0.70 4.51 ±0.61治療后 2.11 ±0.32* # 2.01 ±0.31*#

表6 治療后炎性因子水平比較 ± s

表6 治療后炎性因子水平比較 ± s

注:與治療前比較，* P ＜0.05;與治療A 組比較，#P ＜0.05

組別 MCP-1(μg/L) hs-CRP(mg/L) TNF-α(ng/L) IL-6(ng/L) IL-18(ng/L)治療A 組(n =28)治療前 271.24 ±33.12 20.06 ±2.88 19.12 ±3.02 121.24 ±18.55 104.23 ±13.45治療后 259.31 ±38.65 18.51 ±3.28 18.65 ±3.08 116.78 ±19.12 98.58 ±14.34治療B 組(n =32)治療前 283.45 ±35.65 20.00 ±3.13 20.97 ±3.12 130.53 ±19.58 112.14 ±14.54治療后 78.34 ±10.23* # 5.52 ±0.94* # 9.31 ±1.12* # 37.31 ±5.54* # 43.53 ±5.24*#

3 討論

DN 是DM 一種主要的微血管并發(fā)癥。其病理特點是腎臟血流灌注增加、清蛋白濾出增加，腎小球基底膜增厚，細(xì)胞外基質(zhì)在腎小球系膜為主的區(qū)域進(jìn)行性積聚，造成腎小球硬化、腎小管纖維化、間質(zhì)纖維化，最終引起腎衰。DN 的發(fā)病包含多種細(xì)胞、分子及其相關(guān)因子，是一種多因素參與的疾病，代謝紊亂、炎癥信號通路、腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)激活、血流動力學(xué)改變、氧化應(yīng)激、細(xì)胞因子等參與了DN 的發(fā)生和發(fā)展。

近年來，炎性反應(yīng)成為DN 發(fā)病機(jī)制的研究熱點。TLR4 是Toll 樣蛋白受體家族的重要成員，主要分布在中性粒細(xì)胞、單核巨噬細(xì)胞、腎小管上皮細(xì)胞表面或細(xì)胞內(nèi)，能夠識別細(xì)菌脂多糖等配體并與之結(jié)合啟動髓樣分化因子88(MyD88)依賴性和MyD88 非依賴性信號級聯(lián)反應(yīng)，通過激活核因子κB(NFκB)促進(jìn)hs-CRP、TNF-α、IL-6 等炎性因子釋放，從而激發(fā)一系列的炎癥信號通路，引起細(xì)胞外基質(zhì)增厚、腎小管間質(zhì)纖維化、腎小球硬化，最終導(dǎo)致腎功能障礙。李貞瓊等［3］研究表明，DN 模型鼠腎組織中TLR4 異常高表達(dá)，可能通過誘發(fā)炎性反應(yīng)在腎小球硬化的發(fā)生及進(jìn)展中發(fā)揮重要作用。Verzloa 等［4－6］研究發(fā)現(xiàn)，DN 患者外周血單個核細(xì)胞TLR4 表達(dá)較健康對照組顯著升高，且TNF-α 水平呈正相關(guān)。

本研究采用Real time-PCR 和Western blot 檢測了60 例DN 患者外周血單個核細(xì)胞TLR4 mRNA 和蛋白表達(dá)，結(jié)果表明:與對照組比較，DN 患者外周血單個核細(xì)胞TLR4 mRNA 和蛋白表達(dá)顯著上調(diào)(P ＜0.05)，與前人研究結(jié)果［4－6］一致，說明TLR4 信號通路的激活及其介導(dǎo)的慢性炎性反應(yīng)在DN 發(fā)病機(jī)制中具有重要作用。此外，本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，百令膠囊治療后DN 患者外周血單個核細(xì)胞TLR4 mRNA 和蛋白表達(dá)、MCP-1、hs-CRP、TNF-α、IL-6、IL-18 水平均顯著降低(P ＜0.05)，提示百令膠囊具有明顯的抗炎作用，且這一作用與TLR4 炎癥信號通路的抑制有關(guān)。因此，監(jiān)測TLR4 信號通路及血清炎性因子水平可作為判斷疾病嚴(yán)重程度及療效評估的可靠指標(biāo)。

綜上所述，DN 患者外周血單個核細(xì)胞TLR4 信號通路激活及其介導(dǎo)的慢性炎性反應(yīng)參與了DN 的發(fā)生發(fā)展。百令膠囊治療DN 能夠?qū)崿F(xiàn)保護(hù)腎功能，延緩腎臟損害的治療目的，其機(jī)制與抑制TLR4 信號通路激活及炎性因子的分泌和釋放有關(guān)，這可能是百令膠囊發(fā)揮治療作用的機(jī)制之一，同時TLR4 炎癥信號通路也可能成為治療DN 的潛在靶點。

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