HIF－1α 及STAT3 聯合預測異時性結直腸癌肝轉移*

王 強，郭德正，劉焱偉，史 佳，黃 健，郝朗松

(1.貴州醫科大學 外科教研室，貴州 貴陽 550004;2.貴州省人民醫院 普外科，貴州 貴陽 550000;3.六安市立醫院 普外科，安徽 六安237000;4.十堰市太和醫院 普外科，湖北 十堰 442000)

結直腸癌治療后的異時性肝轉移(colorectal liver metastases，CRLM)是導致結直腸癌治療失敗及死亡的主要原因［1］。盡管轉化治療提高了CRLM 的可切除率，但效果仍不理想［2］。國外研究表明CRLM 危險因素中較為肯定的有年齡、術前癌胚抗原(CEA)水平［3］，但上述危險因素是否可用于國內患者尚存在爭議。缺氧誘導因子1α(Hypoxia inducible factor，HIF－1α)是腫瘤在低氧狀態下生物學特性改變的始動因素，其表達程度及穩定性與腫瘤的生物學特性、臨床密切相關。既往研究證實HIF－1α 的表達程度與結直腸癌的預后、復發、生存、轉移、亞型分類、腫瘤侵襲性相關［4］。信號傳導轉錄激活因子3(Signal transducers and activators 3，STAT3)是HIF－1α 的協同刺激因子，可激活HIF－1α 下游目標基因(如血管內皮生長因子等)并驅動低氧環境下的HIF－1α 依賴性腫瘤發生［5］。本研究對2012 年3 月～2014 年8 月收治的68 例初診結直腸癌患者的腫瘤組織中HIF－1α 與STAT3 蛋白水平進行測定，探討HIF－1α與STAT3 蛋白水平與CRLM 發生率之間的關系，報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

2012 年3 月～2014 年8 月收治的初診結直腸癌患者68 例，男性43 例，女性25 例，中位年齡58歲(36 ～81 歲)。所有患者均經病理活檢確診，腫瘤位于直腸41 例、結腸27 例;腫塊型腫瘤34 例，潰瘍型21 例，浸潤型13 例;高分化19 例，中度分化40 例，低分化8 例;中腺癌45 例，黏液腺癌18例，未分化癌5 例;Ⅰ～Ⅱ期30 例，Ⅲ～Ⅳ期38例;淋巴結轉移36 例，無轉移32 例;脈管侵犯29例，無脈管侵犯者39 例。對照組為結直腸息肉患者35 例，亦經內鏡下病理活檢確診。結直腸癌的治療均參照2010 年NCCN《結直腸癌診療指南中文版》進行。

1.2 觀察指標

1.2.1 HIF－1α 及STAT3 的表達 所有受檢者內鏡下所取部分組織標本迅速凍存至－80 ℃，用以檢測HIF－1α 及STAT3 的表達。采用Western－blot 法，利用液氮、研缽粉碎組織，加入RIPA 緩沖液，PMSF，采用Polytron 4 ℃15 000 r/min 勻漿1 min，移入離心管4℃15 000 r/min 離心15 min，取上清液，采用二喹啉甲酸(BCA，東莞市瓦里西化工有限公司)定量總蛋白。取30 μg 總蛋白經10%聚丙烯凝膠電泳、聚偏氟乙烯(PVDF)膜+5%脫脂牛奶室溫封閉后，加入HI－1α(上海常斤生物科技有限公司)、STAT3 一抗(上海安妍生物科技有限公司)，4 ℃過夜孵育，洗膜后加入二抗，室溫孵育1 h 再次洗膜，經化學發光(ECL)曝光(2 min)、顯影(1 min)及定影，用凝膠圖像處理系統分析蛋白條帶灰度值，以β－actin 作為內參，按HIF－1α(或STAT3)/β－actin 計算兩者的相對表達量。分析比較CRLM 病例與非CRLM 病例臨床資料及HIF－1α 和STAT3 表達。

1.2.2 隨訪 所有患者隨訪6 ～22 月。

1.3 統計學分析

采用統計學軟件SPSS 19.0 對數據進行分析。計量資料用均數±標準差表示，均數比較采用單因素方差分析，組內比較采用LSD 法。計數資料采用非參數檢驗的Fisher exact test 及Kruscal Wallis H 檢測進行評估。P ＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 臨床資料

經系統治療后，68 例結直腸癌患者中，11 例在隨訪過程中出現CRLM(11/68，16.18%)。與初診時的臨床特征比較，非CRLM 組淋巴結轉移患者明顯低于CRLM 組，差異有統計學意義(P=0.036)，而年齡、性別、腫瘤直徑、腫瘤形態、分化程度、TNM分期、脈管侵犯等因素在CRLM 組與非CRLM 組間差異無統計學意義(P ＞0.05)。見表1。

2.2 STAT3 及HIF－1α 的蛋白表達

3 組患者STAT3、HIF－1α 蛋白表達水平兩兩比較，CRLM 組＞非CRLM 組＞對照組，差異有統計學意義(P ＜0.05)。見圖1。

2.3 STAT3+、HIF－1α+不同組合時，CRLM 的發生率

STAT3 蛋白相對表達量中位數為2.1，HIF－1α 蛋白相對表達量中位數為1.7。分別根據蛋白表達的中位數將患者分為陰性組(≤中位數組，n=34)及陽性組組(＞中位數組，n=34)。不同組合見表2，結果顯示初診結直腸癌患者治療前活檢腫瘤組織STAT3、HIF－1α 同時過表達時，患者出現異時性CRLM 的幾率明顯高于單獨過表達或均不過表達的患者(P ＜0.05)。見表2。

表1 非CRLM 組與CRLM 組患者就診時臨床特征Tab.1 Comparison of clinical features between CRLM and non－CRLM group

圖1 不同分組中的HIF－1α、STAT3蛋的表達水平Fig 1.The variation trend of relative expression level of STAT3 and HIF－1αh group

表2 兩組結直腸癌患者STAT3+與HIF－1α+不同組合時，CRLM 發生率Tab 2.The incidence rate of CRLM in terms of different combination of HIF－1α and STAT3 protein expression

3 討論

腫瘤細胞的相對缺氧可應激性的導致HIF－1α 表達上調，并驅動糖酵解及腫瘤細胞的能量代謝及生物學特性改變，其上調程度與腫瘤患者的生存率、緩解率呈負相關，并可導致耐藥及預后不良(獨立危險因素)［6－8］。有研究表明HIF－1α 在結直腸癌早期即出現高表達，且隨病程進展進行性增高，可作為肝臟轉移的獨立危險因素，而其他相關分子標記物如P53，血管內皮生長因子(VEGF)，Glut－1 及癌胚抗原－9(CA－9)等卻并未顯示出類似的相關性［9－11］。STAT3 可協同HIF－1α 激活HIF－1α 的下游基因并驅動低氧環境下的HIF－1α 依賴性腫瘤發生，并與人結直腸癌的臨床特征、預后密切相關［12－14］。然而，目前尚無關于STAT3與HIF－1α 協同表達與結直腸癌CRLM 的相關臨床報道。

本研究中，除淋巴結轉移因素與CRLM 的發生有關外，與年齡、性別、腫瘤部位、直徑、形態、分化程度、分期、脈管侵犯等因素無關。與既往研究傾向于將結直腸癌治療前的淋巴結轉移、年齡等作為異時性CRLM 的危險因素的觀點不符［8－14］?？赡苁怯捎诒敬窝芯繕颖玖枯^小所致。本研究還發現3 組患者STAT3、HIF－1α 蛋白表達水平兩兩比較，CRLM 組＞非CRLM 組＞對照組，差異有統計學意義(P ＜0.05)。該結果與既往研究相同［10］。

本研究還對STAT3、HIF－1α 過表達(＞中位數)及未過表達(≤中位數)及其不同組合時的CRLM 發生率進行比較。結果表明當STAT3、HIF－1α 同時過表達時，患者出現異時性CRLM 的發生率為60%，明顯高于兩者均未過表達患者的10%。提示STAT3、HIF－1α 的蛋白表達程度聯合分析可有效預測患者發生異時性CRLM 的發生率，可幫助臨床醫師在治療前進行風險評估及制定更為有效的個體化治療方案。

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