早期自然流產絨毛外滋養細胞VEGF 的表達及意義

楊倩 盧麗莉 梁珊 畢秀霞 韓彥潔 宋春紅 劉洋

在妊娠早期，滋養細胞發育和分化為構成絨毛的滋養細胞(合體滋養細胞和細胞滋養細胞)及絨毛外滋養細胞(extravillous trophoblast，EVT)。EVT 增殖侵入蛻膜組織，具有類似腫瘤的增殖浸潤能力［1］。其中，浸入子宮蛻膜間質甚至淺肌層的稱絨毛外中間滋養細胞(interstitial extravillous trophoblast，IET)，侵入母體血管的絨毛外滋養細胞稱為血管滋養細胞(endovascular extravillous trophoblast，ET)。EVT 以旁分泌，自分泌的方式受滋養細胞及子宮分泌的多種激素及細胞因子的調節，對母體-胎兒血液循環的建立和維持正常妊娠起著至關重要的作用。研究顯示，血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)是高效的促有絲分裂因子，除了促進子宮內膜和蛻膜組織中血管形成和發育的重要作用［2，3］外，VEGF 還具有增加體外培養的EVT 增殖力的作用［4］。關于流產時外周血及絨毛VEGF 的表達研究［5，6］較多，但絨毛外滋養細胞VEGF 的表達是否發生變化筆者在國內外尚未見報道。因此本實驗通過觀察自然流產絨毛外滋養細胞VEGF 表達的變化探討早期自然流產可能的發生機制，為早期自然流產時VEGF 的表達改變提供佐證，探討自然流產治療的新方向。

1 資料與方法

1.1 一般資料 流產組:2013 年3 月至2014 年3 月期間在石家莊市第四醫院門診或住院患者，妊娠7 ～9 周，選擇經B 超檢查診斷為胚胎在宮內死亡尚未自然排出且病因不明(夫妻雙方與流產有關的檢查均正常)者，共20 例。對照組:同期在我院門診自愿要求行人工流產的健康女性20 例，均無死胎、死產、自然流產史，本次妊娠期間無先兆流產的癥狀和體征，B 超檢查提示胚胎發育正常，無用藥、病毒感染以及X 線接觸史。2 組年齡及孕周均無統計學意義(P ＞0.05)。

1.2 標本的采集及處理 2 組均采用可視人工流產手術，從刮出物中取絨毛及絨毛種植部位蛻膜組織(底蛻膜)，0.9%氯化鈉溶液漂洗后，置于10%中性甲醛溶液中固定6 ～12 h，梯度乙醇脫水后石蠟包埋，5 μm切片。

1.3 HE 染色及底蛻膜的辨別 在HE 染色切片下觀察底蛻膜組織中的絨毛外滋養細胞是無清晰邊界的多角形細胞，含豐富的雙染性胞質，核深染，不規則，具有輕度多形性。蛻膜細胞具有清晰的細胞膜，輕度嗜伊紅的胞質和卵圓形的細胞核。當兩者鑒別困難時，加用免疫組化染色CK 和HPL 加以鑒別。選取有底蛻膜成分的臘塊，切片進行免疫組化檢測。

1.4 免疫組織化學染色 所用一抗為兔抗人VEGF多克隆抗體購自福州邁新生物技術開發公司，運用SP 法檢測兩組底蛻膜及絨毛組織VEGF 的表達。免疫組化檢測試劑盒(SP-9001)和DAB 酶底物顯色試劑盒購自北京中杉金橋生物技術有限公司。操作嚴格按免疫組化檢測試劑盒說明書要求進行，DAB 顯色，蘇木精復染。陰性對照以PBS 代替一抗進行。

1.5 結果判斷標準 采用雙盲法在顯微鏡下(10 ×10)觀察中間滋養細胞及血管內著色情況，以細胞內出現棕黃色顆粒為VEGF 表達陽性，每張切片隨機觀察10 個視野。免疫組化染色結果采用半定量“Quickscore”法［7］判讀，細胞染色強度:0 =陰性;1 =弱陽性;2 =中等程度陽性;3 =強陽性;細胞染色密度:1 =0 ～25%;2 ＞ =25 ～50%;3 ＞ = 50 ～75%;4 ＞ =75 ～100%。細胞染色強度和密度的得分相乘再相加得到0 ～12 分的變化范圍。

1.6 統計學分析 應用SPSS 18.0 統計軟件，計量資料以± s 表示，進行單因素方差分析(One-Way ANOVA)和t 檢驗，P ＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

自然流產組VEGF 表達較對照組降低，表現為免疫反應積分(IRS)明顯減少(P ＜0.05)。見表1。

3 討論

成功的妊娠是子宮內膜蛻膜化、胎盤形成和胚胎發育三方面協同作用的結果。胎盤著床及胎盤絨毛的正常發育對于母體－胎兒循環的建立至關重要，胚胎的EVT 侵入母體的蛻膜組織是影響胎盤著床及發育的重要環節之一［1］，EVT 在妊娠早期主要位于胎盤著床部位，為提供足夠的營養物質和氧氣給胎盤及胎兒，EVT 侵入子宮蛻膜組織和淺肌層形成中間滋養細胞，還有一部分EVT 侵入子宮螺旋動脈，引起螺旋動脈管壁結構改建［3］(管腔擴張，管壁通透性增高，管壁肌性結構消失及纖維蛋白沉積等)，使子宮動脈壓力降低并富于血運，從而供應日益增長的胎盤及胎兒的營養需要。EVT 增殖，遷移及侵入蛻膜及血管的過程受很多局部信號分子的調節，包括各種亞型的VEGF、血管緊張素家族(Ang-1，Ang-2)，TGF-b，肝細胞生長因子及干擾素等。其中，VEGF 是最強的血管生成促進因子，它具有促進血管內皮細胞分裂，誘導新生毛細血管形成及增加血管通透性等重要作用［2，3］，因此廣泛參與了胚胎發育、器官形成、腫瘤發生等一系列生理病理過程［3，8，9］。研究表明，生理妊娠時，VEGF 廣泛表達于蛻膜、絨毛組織及子宮內膜腺體［5，10］，表明VEGF 在生理妊娠及胚胎發育中發揮了重要作用［1，5］。Schiessl等［5］的研究表明，妊娠早期EVT 存在VEGF 及其受體flt-1 的表達。我們的研究顯示，人工流產女性(對照組)絨毛外滋養細胞VEGF 免疫組化染色陽性，即EVT 表達VEGF，與Schiessl 等［5］的研究結果是一致的。造成這種差異的原因可能與妊娠不同時相表達VEGF 亞型不同和所用的VEGF 免疫組化抗體的不同有關，Schiessl 發現，VEGF 存在不同的亞型(VEGF-A，C，D)。隨妊娠周數的增加，EVT 表達的VEGF 亞型也發生變化［5］。可能由于所用的不同免疫抗體針對亞型抗原決定簇的不同，使得在妊娠早期EVT 表達VEGF 的實驗結果出現了差異。

表1 IRS 比較 n =20， ± s

表1 IRS 比較 n =20， ± s

注:與對照組比較，* P ＜0.05

IRS對照組組別7.75 ±2.25自然流產組 5.25 ±1.98*

自然流產發生率較高，是婦產科常見的病理性妊娠之一，其病因涉及染色體、內分泌和免疫異常等諸多因素，尚有部分自然流產病因不清。自然流產及復發性流產時，患者血清及絨毛組織VEGF 表達水平的研究較多［6，11］，且研究結果存在較大差異，造成這種差異的原因不明，而早期自然流產時底蛻膜組織中絨毛外滋養細胞VEGF 的表達國內外尚未見報道。本實驗通過免疫組化染色法發現，自然流產患者底蛻膜組織EVT(包括中間滋養細胞和血管滋養細胞)VEGF 表達與正常對照組相比是降低的，可能通過如下機制參與了自然流產的發生:(1)正常對照組EVT 表達VEGF及Flt-1 的表達模式說明IET 通過旁分泌和自分泌VEGF 的方式受到VEGF 作用，研究表明，VEGF 具有增加培養的絨毛外滋養細胞增殖力的作用［4］，EVT 表達VEGF 減少，可能抑制了EVT 的增殖活性，使發育中的EVT 數量不同程度減少，胎盤對子宮內膜的錨定作用和營養吸收功能減弱;(2)ET 分泌VEGF 減少，ET 向螺旋小動脈侵入的過程受挫，抑制了子宮螺旋動脈的生理性轉化，子宮螺旋動脈不能適時擴張，子宮血循環壓力未能及時下降，影響了母胎交界的營養交換;(3)自然流產時，子宮處在相對缺氧的環境中，VEGF在體外的絨毛膜癌細胞系BeWo 通過激活Nrf2 途徑減少氧化損傷，VEGF 的表達下降，使得EVT 耐受缺氧應激的能力下降，EVT 結構和功能受損;當上述機制累積到一定程度最終使得流產難免發生。綜上所述，EVT 表達VEGF 水平的下降可能促進了自然流產的發生。在妊娠早期，如能選擇性的增加VEGF 的表達或開發激活EVT 的藥物，可能為自然流產的治療提供新的途徑。

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