超高效液相色譜-串聯質譜法測定煙用水基膠中鄰苯二甲酸酯類化合物

閻 瑾，鮑峰偉，牛麗娜，劉 輝，蘇國歲

(河北中煙工業有限責任公司 技術中心，河北 石家莊 050051)

超高效液相色譜-串聯質譜法測定煙用水基膠中鄰苯二甲酸酯類化合物

閻 瑾，鮑峰偉*，牛麗娜，劉 輝，蘇國歲

(河北中煙工業有限責任公司 技術中心，河北 石家莊 050051)

建立了一種測定煙用水基膠中17種鄰苯二甲酸酯類(PAEs)化合物的超高效液相色譜-串聯質譜(UPLC-MS/MS)法。樣品經水分散，以甲醇定容，渦旋振蕩萃取。萃取液離心后，過有機相濾膜進行UPLC-MS/MS分析。通過增加延時柱的方法，排除色譜系統帶入的PAEs干擾。結果表明：在0～5 μg/mL范圍內，方法的線性關系良好，相關系數均大于0.994，定量下限為0.010～0.479 μg/g。該方法的回收率為87.6%～106.0%，相對標準偏差(RSD,n=6)為0.8%～6.2%。將該方法與YC/T 333-2010標準方法進行對比，結果顯示兩種方法的檢測數據不存在顯著性差異。方法用于煙用水基膠中17種PAEs的測定，操作簡單，穩定性好。

鄰苯二甲酸酯；超高效液相色譜-串聯質譜；煙用水基膠；延時柱

鄰苯二甲酸酯(Phthalate acid esters,PAEs)是一類揮發性低、穩定性高且無味或具有芳香氣味的物質，具有增強聚合物的可塑性、柔韌性和流動性等作用，被作為塑化劑廣泛使用[1]。PAEs已被證明對人體和環境具有危害性[2-4]，并且易從聚合物中釋放[5]，因此各國對此類物質的使用均有嚴格規范[6-8]。

煙用水基膠中PAEs的測定一般采用氣相色譜-質譜聯用[9]和液相色譜[10]法。煙草行業標準YC/T 333-2010[11]規定了7種PAEs的檢測方法，但未能完全覆蓋明確和疑似[12-14]對人體有危害的PAEs種類，因此參照相關法規及檢測標準[11,15-21]，本文選取17種PAEs為待測化合物。由于氣相色譜對于碳原子數較多的異構體化合物(如鄰苯二甲酸二異壬酯(DINP)等)分離效果較差，峰形重疊，定性定量難度大，因此，本文采用液相色譜-串聯質譜法對樣品進行檢測。由于液相色譜流路多為聚四氟乙烯材質，工作中會帶入多種PAEs干擾物，干擾定量，為解決該問題，在液相色譜高壓泵和自動進樣器六通閥之間增加一根延時柱，系統帶入的PAEs經延時柱保留，滯后進入分析柱，通過延長保留時間排除干擾，從而降低了測試的不確定性，提高了數據的可靠性。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

Agilent1290超高效液相色譜(美國Agilent公司)，配有G4220A二元泵，G4226A自動進樣器和G1316C柱溫箱；Agilent 6430三重四極桿質譜儀(美國Agilent公司)，配有電噴霧離子源(ESI)；AG285電子天平(瑞士梅特勒托利多公司)；基本型多管式旋渦混合器(美國Talboys公司)；LG16-WA型高速離心機(北京京立離心機有限公司)。

17種鄰苯二甲酸酯類標準品：鄰苯二甲酸二甲酯(Dimethyl phthalate,DMP)、鄰苯二甲酸二乙酯(Diethyl phthalate,DEP)、鄰苯二甲酸二丁酯(Dibutyl phthalate,DBP)、鄰苯二甲酸二環己酯(Dicyclohexyl phthalate,DCHP)、鄰苯二甲酸二異丁酯(Diisobutyl phthalate,DIBP)、鄰苯二甲酸二(4-甲基-2-戊基)酯(Bis(4-methyl-2-pentyl) phthalate,BMPP)、鄰苯二甲酸二(2-乙氧基乙基)酯(Bis(2-ethoxyethyl) phthalate,DEEP)、鄰苯二甲酸二苯酯(Diphenyl phthalate)、鄰苯二甲酸二(2-丁氧基乙基)酯(Bis(2-n-butoxyethyl) phthalate,DBEP)、鄰苯二甲酸二異壬酯(Diisononyl phthalate,DINP)，純度均為99%；鄰苯二甲酸二戊酯(Dipentyl phthalate,DPP)、鄰苯二甲酸丁基芐酯(Benzyl butyl phthalate,BBP)、鄰苯二甲酸二(2-乙基己基)酯(Di(2-ethylhexyl) phthalate,DEHP)、鄰苯二甲酸二壬酯(Dinonyl phthalate,DNP)、鄰苯二甲酸二正辛酯(Di-n-octyl phthalate,DNOP)，純度均為98%；鄰苯二甲酸二己酯(Dihexyl phthalate,DHXP，97%)；鄰苯二甲酸二(2-甲氧基乙基)酯(Bis(2-methoxyethyl) phthalate,DMEP，96%)，上述標準品均由美國Alfa Aesar提供。

甲醇、乙腈(美國J.K.Baker公司)，甲酸(美國Alfa Aesar公司)，乙醇(韓國Duksan公司)，異丙醇(美國Tedia公司)，以上試劑均為色譜純，實驗用水為去離子水。煙用水基膠樣品由生產廠家提供。

為防止實驗過程中外部環境對目標化合物檢測的干擾，需對實驗所用玻璃器皿進行預處理，玻璃器皿洗凈后用一級水淋洗3次，經丙酮浸泡1 h，室溫揮干后，置于200 ℃烘箱中2 h，實驗過程中避免使用塑料制品[11]。

1.2 樣品制備

準確稱取0.30 g(精確至0.01 g)混合均勻的水基膠樣品于10 mL容量瓶中，立即加入2 mL水分散樣品，用甲醇定容至刻度后，全部轉移至10 mL離心管中。渦旋振蕩10 min，在10 000 r/min條件下離心5 min，取上層清液過0.45 μm有機相濾膜后進行UPLC-MS/MS分析。

1.3 UPLC-MS/MS條件

色譜柱：ZORBAX SB-C18(3.0 mm×100 mm，1.8 μm，Agilent);延時柱：ZORBAX Eclipse Plus C18(2.1 mm×50 mm，1.8 μm，Agilent)；流動相：A為0.1%甲酸水溶液，B為0.1%甲酸甲醇溶液；柱溫：50 ℃；進樣量：2 μL；流速：0.4 mL/min；梯度洗脫程序：0.0～1.0 min，45% B；1.0～4.0 min，45%～65% B；4.0～8.0 min，65% B；8.0～15.0 min，65%～80% B；15.0～16.0 min，80%～90% B；16.0～20.0 min，90%～100% B；20.0～25.0 min，100% B；25.0～25.1 min，100%～45% B；25.1～30.0 min，45% B。

掃描模式：電噴霧正離子掃描ESI(+)；毛細管電壓：4 000 V；干燥氣：氮氣；氣流量：10 L/min；溫度：350 ℃；霧化器壓力：15 psi；碰撞氣：高純氮氣；監測方式：多反應監測(MRM)。

2 結果與討論

2.1 萃取溶液的選擇

為選擇適宜的萃取溶液，分別考察了甲醇、乙醇、異丙醇和乙腈4種溶劑對50 μg/g加標樣品的萃取效果(以回收率為參考指標)。為保證所選溶劑具有充分的萃取能力，設定稱樣量為0.5 g，其余操作按“1.2”和“1.3”條件進行。

表1測試結果表明，4種溶劑對17種PAEs的整體回收率大小順序依次為：甲醇>乙醇>乙腈>異丙醇。其中，異丙醇的回收率很低，可能與樣品未能完全分散于異丙醇中、膠體結塊有關；甲醇、乙醇、乙腈3種溶劑的回收率均大于82%，能夠較為完全地萃取測試樣品中的PAEs。結合萃取過程中樣品的狀態，認為溶劑對膠體的分散能力是影響回收率的主要因素，對PAEs的溶解能力屬于次要因素。由于以甲醇為溶劑對樣品具有較好的分散效果和較高的回收率，并且方法的流動相為甲醇，故選擇甲醇為萃取溶劑。

表1 不同萃取溶液下PAEs的測定回收率

2.2 萃取方式及時間

煙用水基膠的主要成分是聚乙酸乙烯酯，易分散于水中，較難分散于有機溶劑。為確保樣品被充分混勻，在加入萃取溶液前先加入2 mL水稀釋膠液，并采用旋渦混合器進行萃取。分別在萃取0，5，10，15，20，30 min時檢測樣品的PAEs含量。結果表明，萃取5 min后，各化合物的測定值趨于穩定，為保證萃取完全，選擇萃取時間為10 min。

圖1 干擾排除效果圖

2.3 系統干擾的排除

液相色譜流路多為聚四氟乙烯材質，工作中會帶入多種PAEs干擾物，經空針實驗發現，本文的液相色譜系統中，DIBP，DBP，DNOP的空白值很高，對測定結果存在較大干擾。為此，在高壓泵和自動進樣器六通閥之間接入一根延時色譜柱，以達到排除干擾的作用(圖1)。其工作原理為：梯度洗脫模式下，有機相初始比例較低，洗脫能力較弱，因此在進樣之前，色譜系統帶入的PAEs被吸附在延時柱中，隨著進樣后流動相中有機相比例的逐漸提高，延時柱中保留的PAEs被依次洗脫進入分析柱，因此始終比樣品中的PAEs延后流出分析柱，二者保留時間不同，從而達到排除干擾的目的。

2.4 質譜條件的選擇

以質量濃度為100 μg/mL的鄰苯二甲酸酯標準溶液進樣，在正離子模式下進行全掃描，得到PAEs母離子，對母離子進行子離子掃描，得到子離子信息，選取豐度較強、干擾較小的兩組離子作為定量和定性離子。為了達到更高的靈敏度，對解離電壓、碰撞能量等參數進行優化，結果見表2。按上述優化條件對17種鄰苯二甲酸酯標準品進樣分析，得到MRM圖(圖2)。

表2 17種鄰苯二甲酸酯類化合物的MRM參數和保留時間

*quantitative ion

圖2 17種鄰苯二甲酸酯標準溶液的MRM圖

2.5 基質效應的考察

LC-MS/MS中的基質效應是由分析物的共流出組分影響電噴霧接口的離子化效率所致，表現為離子增強或抑制作用[22]。因此參照文獻方法[23-24]，考察了基質效應對本實驗的影響。

取水基膠樣品，按0，5，10，20，50，100，150 μg/g的添加量加入混合標準溶液，按“1.2”與“1.3”方法進行處理分析，并繪制基質加標標準曲線。同時繪制同濃度范圍的純溶劑標準曲線。取同一水基膠樣品(加標量40 μg/g)，按上述方法進行處理分析。

以上述兩條曲線分別計算加標回收率，比較測定過程中的基質效應。實驗結果表明，溶劑校準曲線計算所得PAEs 的平均回收率為87%～106%，基質加標校準曲線計算所得PAEs的回收率為89%～105%，二者無明顯差異，因此本實驗的基質效應對測定結果無明顯影響。

2.6 線性范圍、標準曲線、檢出限及定量下限

取17種PAEs的混合標準溶液，用甲醇配制質量濃度分別為0，0.1，0.2，0.5，1，2，5 μg/mL的系列標準溶液，按“1.3”條件進行UPLC-MS/MS分析，以各PAEs的峰面積(Y)為縱坐標，對應質量濃度(X，μg/mL)為橫坐標作圖，得線性方程及相關系數(見表3)。 結果表明，17種PAEs在0 ～5 μg/mL范圍內具有良好的線性關系，相關系數(r)均大于0.994。將0.1 μg/mL標準溶液重復進樣10次，以3倍標準偏差(S/N=3)作為方法的檢出限，10倍標準偏差(S/N=10)作為定量下限，17種PAEs的檢出限為0.003～0.144 μg/g，定量下限為0.010～0.479 μg/g。

2.7 回收率與精密度

取同一水基膠樣品，分別加入低、中、高(10，40，150 μg/g)3個水平的混合標準溶液，進行處理分析，各水平平行測定6次，計算回收率(見表3)。結果表明，17種PAEs的平均回收率為87.6%～106.0%，說明測定方法的結果比較準確，適用于煙用水基膠中PAEs的檢測。

取同一水基膠樣品6份，按20 μg/g的水平加入混合標準溶液，根據測定結果計算相對標準偏差(RSD)以表征測量精密度(見表3)。由表可見，各待測組分的相對標準偏差為0.8%～6.2%，表明本方法的重復性較好。

表3 17種鄰苯二甲酸酯類化合物的線性方程、相關系數、檢出限(LOD)、定量下限(LOQ)、回收率及相對標準偏差(RSD)

2.8 實際樣品的檢測及與標準方法的比較

選取10種煙用水基膠樣品，分別采用本法和YC/T 333-2010[11]標準方法測定PAEs含量(表4)。除去未檢出的DEP，BBP和DNOP，兩種方法有4組可比數據。由于不同樣品間PAEs的含量差異很大，對原始數據取自然對數后進行配對t檢驗。結果表明，PDMP=0.330，PDIBP=0.311，PDBP=0.493，PDEHP=0.770，4組可比數據的P值均大于0.05，表明兩種方法的檢測結果不存在顯著性差異。圖3為某一實際樣品中各化合物的典型LC-MS/MS譜圖。

表4 煙用水基膠樣品中17種PAEs的含量

(續表4)

Compound1#2#3#4#5#6#7#8#9#10#DBP3 513 254 653 493 664 082 293 742 932 16DBEP-0 010 010 010 010 010 020 040 010 01DPP0 020 030 020 020 040 020 05-0 020 02DCHP0 020 040 03-0 030 020 07-0 080 02BMPP6 025 375 786 256 166 296 575 808 216 58DHXP6 615 716 436 916 797 007 276 418 936 93DEHP5 803 5016 454 005 127 512 664 554 872 64DNOP----------DINP----------DNP----------DMP??16 8512 2841 176 2523 3514 240 1620 479 700 06DEP??----------DIBP??16 2413 5633 776 9916 4314 810 9715 7111 610 94BBP??----------DBP??3 593 275 333 044 163 642 353 712 501 86DEHP??5 993 4515 453 515 446 512 374 784 483 11DNOP??----------

*no detected,**detection result of YC/T 333-2010 standard method

圖3 實際樣品的MRM圖

3 結 論

本文建立了一種煙用水基膠中17種PAEs的UPLC-MS/MS分析方法。采用旋渦混合器萃取樣品，使樣品與萃取溶劑充分混合，確保PAEs能萃取完全，并通過增加延時柱，排除了色譜系統帶入的PAEs對樣品測定的干擾，降低了空白值，提高了測試的穩定性和可靠性。本方法在測試指標上較YC/T 333-2010具有更廣的覆蓋范圍，且兩種方法的檢測數據不存在顯著性差異，操作簡單，穩定性好，定量下限為0.010～0.479 μg/g，回收率為87.6%～106.0%。

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Determination of Phthalate Acid Esters in Water-borne Adhesives for Cigarette by UPLC-MS/MS

YAN Jin,BAO Feng-wei*,NIU Li-na,LIU Hui,SU Guo-sui

(Technology Center,China Tobacco Hebei Industrial Co.,Ltd.,Shijiazhuang 050051,China)

A method for the determination of 17 phthalate acid esters(PAEs) in water-borne adhesives for cigarette by ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry(UPLC-MS/MS)was developed.The samples were dispersed with water and dissolved with methanol at constant volume,then extracted with a vortex mixer vigorously and centrifuged.After passed through an organic phase filter membrane,the extract was analyzed by UPLC-MS/MS.The interference of PAEs that chromatography system introduced was removed with a delay column.The results showed that,the calibration curves of 17 PAEs showed good linearities in the range of 0-5 μg/mL,with correlation coefficients greater than 0.994.The limits of quantitation were in the range of 0.010-0.479 μg/g.The recoveries ranged form 87.6% to 106.0% with relative standard deviations(RSDs,n=6) of 0.8%-6.2%.Compared with YC/T 333-2010 standard method,there was no significant difference between the data obtained by two methods.With the advantages of simplicity and stability,this method was used for the determination of 17 PAEs in water-borne adhesives.

phthalate acid esters;UPLC-MS/MS;water-borne adhesives for cigarette;delay column

2014-09-11;

2014-09-30

10.3969/j.issn.1004-4957.2015.02.002

O657.63；TQ414.1

A

1004-4957(2015)02-0134-07

*通訊作者：鮑峰偉，碩士，工程師，研究方向：煙草化學分析，Tel：0311-66006953，E-mail：bfwmail@yeah.net