MALDI質譜分析PEG5000和BSA的實驗教學設計

劉雅琴， 鄒建凱， 裘雅漁

(浙江大學 化學系，浙江 杭州 310027)

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MALDI質譜分析PEG5000和BSA的實驗教學設計

劉雅琴， 鄒建凱， 裘雅漁

(浙江大學 化學系，浙江 杭州 310027)

基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜(MALDI-TOF MS)是質譜分析中新型的大型儀器之一，通過開設新型大型儀器MALDI-TOF質譜的實驗課程，有效地開拓學生的專業視野。針對不同的樣品選擇不同的基質和采取不同的檢測模式，本實驗以不同分子量范圍的兩種代表性樣品聚乙二醇5000和牛血清白蛋白(66 KD)為例，聚乙二醇5000選擇2,5-二羥基苯甲酸作為基質；牛血清白蛋白選擇芥子酸為基質，進行質譜檢測。有效地讓學生了解MALDI儀器的性能和應用范圍，為他們今后從事科學研究工作奠定良好的基礎，也讓大型儀器全面支撐研究生教學，進一步提高了分析儀器的利用率。

MALDI質譜； BSA蛋白； 實驗教學； 大型儀器

0 引 言

在化學分析中，質譜與核磁共振、紅外光譜、紫外光譜被認為是有機結構分析的四大表征工具。有機質譜具有特別重要的地位，是近代分析中的重要技術之一，20世紀80年代末誕生的基質輔助激光解吸電離技術，使傳統的主要用于小分子物質研究的質譜技術發生革命性的變革，擴展到高極性、難揮發和熱不穩定的大分子的分析研究[1-3]。近30年來，質譜發展非常迅速，基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜(Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization Time of Flight Mass Spectrometry，MALDI-TOF-MS)，在大分子領域的應用為質譜的發展注入了新的活力，形成了獨特的生物質譜技術。MALDI-TOF-MS具有靈敏度高、準確度高及分辨率高等優點，為生命科學、醫學和材料科學等領域提供了一種強有力的分析測試手段，發揮著越來越重要的作用[4-11]。

為了開拓學生的專業視野，我系將新型的有機質譜MALDI-TOF MS儀器加入到研究生的儀器分析實驗課程中。本實驗首先用標準品進行儀器的質量校準，然后在反射模式下對聚乙二醇5000 (PEG5000)樣品進行檢測；在線性模式下對牛血清白蛋白樣品(BSA)進行檢測。通過對MALDI質譜檢測參數的微調，分別獲得高分辨的PEG5000質譜圖和相對分子質量為66KD的大分子BSA質譜圖。整個實驗時間控制在3 h以內，操作簡便，可重復性高，適合在研究生實驗教學中應用。

1 實驗原理

儀器主要由兩部分組成：基質輔助激光解吸電離離子源(MALDI)和飛行時間質量分析器(TOF)，如圖1所示。MALDI的原理有多種假說，但公認的一個機制是用激光照射樣品與基質形成的共結晶薄膜，基質從激光中吸收能量傳遞給生物分子，而電離過程中將質子轉移到生物分子或從生物分子得到質子，而使生物分子電離的過程。它是一種軟電離技術，適用于混合物及生物大分子的測定。TOF的原理是離子在電場作用下加速飛過飛行管，根據到達檢測器的飛行時間不同而被檢測，即所測定的離子的質荷比(m/z)與離子的飛行時間成正比。通常在MALDI源中產生的主要是完整的準分子離子，這也是MALDI質譜圖的最大特點之一。由于MALDI所產生的質譜圖多為單電荷離子，其質譜圖中的離子與多肽和蛋白質的質量常常有一一對應關系[12]。

2 儀器與試劑

Bruker公司的基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜儀，型號Ultraflex。聚乙二醇5000購自國藥集團化學試劑有限公司(化學純)，牛血清白蛋白(BSA)購自生工生物工程(上海)股份有限公司， 2,5-二羥基苯甲酸(DHB)和芥子酸(SA) 購自美國布魯克?道爾頓公司(色譜純)。

圖1 MALDI-TOF 質譜儀的構造和原理

3 實驗部分

3.1 實驗流程

實驗流程見圖2。

圖2 MALDI-TOF的實驗流程

3.2 實驗步驟

(1) 樣品的制備。根據樣品的性質和相對分子質量范圍，本實驗選擇兩種代表性樣品聚乙二醇5000和牛血清白蛋白(66 KD)，聚乙二醇5000選擇2,5-二羥基苯甲酸作為基質；牛血清白蛋白選擇芥子酸為基質。移動1 μL樣品和1 μL基質均勻混合，將1 μL混合溶液點在樣品靶上，自然干燥，進行質譜檢測。

(2) 質量校準。選擇相應質量數的校準文件，采集譜圖，進行校準。若誤差值較大，應反復校準，直到滿足要求。如圖3所示，外標物為Bradykinin(1～7) (757.399Da)，Angiotensin II (1 046.542 Da)，Angiotensin I (1 296.695Da)，Substance P (1 347.735Da)，Bombesin (1 619.822 Da)，ACTH_clip(1～17) (2 093.086 Da)，ACTH_clip (18～39) (2 465.198 Da) 和 Somatostatin 28 (3 147.471Da)。

圖3 外標物的質量校準質譜圖

(3) 相對分子量質測定：采用不同模式MALDI-TOF MS 進行分析,儀器參數設置如下：① 測定PEG5000時，激光波長355 nm，加速電壓25.0 kV，反射電壓26.5 kV，脈沖離子提取時間130 ns， 聚焦電壓8.0 kV，反射檢測器電壓2.305 kV。② 測定BSA蛋白時，激光波長355 nm，加速電壓25.0 kV，脈沖離子提取時間500 ns，聚焦電壓34.0 kV。線性檢測器電壓2.955 kV。在測量過程中可隨時調整激光能量和靶板位置以獲得最佳信噪比和分辨率。

(4) 測試結束，退靶，取出靶板，關閉軟件。普通靶板的清洗方法，順序依次為： 熱水擦洗； 甲醇或乙腈擦洗；丙酮或異丙醇浸沒靶板超聲20 min；100% Millipore純水擦洗；自然晾干，放入靶板盒。

4 實驗結果與討論

教學實驗必須具有理論依據明確、操作步驟簡便、結果穩定、再現性高等特點[13]。為了達到上述要求，對基質的選擇、聚乙二醇5000的質譜分析和牛血清白蛋白的質譜分析三個方面做了深入細致地探討。

4.1 基質的選擇

基質的使用是MALDI電離技術的關鍵，基質吸收了激光的大部分能量并氣化，同時將樣品分子帶入氣相，樣品分子只吸收少量的激光能量，避免了被分析物分子化學鍵的斷裂。此外，基質在樣品離子形成過程中還充當質子化或去質子化試劑，使樣品分子帶上正電荷或負電荷。目前，常用于分析蛋白質和多肽的基質是一些能夠很好的吸收和傳遞激光能量小分子的有機酸及其衍生物，實際使用時也需要根據被分析物的要求作相應選擇。一般說來，基質α-氰基-4-羥基肉桂酸(CHCA)適用于多肽類或相對分子質量小于10KD的樣品，芥子酸適用于相對分子質量較大(>10KD)的蛋白質樣品和極性聚合物，而2,5-二羥基苯甲酸則適用于有機合成分子或極性聚合物等樣品，如表1所示。

表1 常用基質的基本信息

4.2 聚乙二醇5000的質譜分析

樣品聚乙二醇5000的質譜圖，如圖4所示，最強峰m/z是5166.152，這與樣品本身的相對分子質量范圍相吻合。其中，質譜峰m/z 5 166.152與5 254.305之間的質量差值為88，可推斷是相差2個CH2CH2O結構單元的分子離子峰，這一結果與樣品本身的是聚乙二醇的特征相一致。反射模式下，樣品分子離子在加速電壓的作用下，飛行至管道末端再受到反射電壓的作用進入反射場區。在進入反射場區前，即在飛行管道末端的延遲電場補償了分子離子的初始空間和能量分布[14]，待離子達到零動能狀態后，再次受到反方向電壓的作用運動至反射檢測器，其飛行距離比線性模式長。因此反射模式提高了質譜分辨率，特別是分子量在4 000 Da以下的分子[15]。

圖4 樣品聚乙二醇5000的質譜圖

4.3 牛血清白蛋白的質譜分析

樣品牛血清白蛋白的質譜圖，如圖5所示，最強峰 m/z 66 161.347對應為牛血清白蛋白的單聚體單電荷分子離子峰，這與文獻報道的牛血清白蛋白的單聚體分子量為66～68KD相吻合。質譜峰 m/z 132 573.981對應為牛血清白蛋白的二聚體單電荷峰，質譜峰 m/z 33048.976對應為牛血清白蛋白的單聚體雙電荷峰，剩下的可能是雜質峰。在線性模式下，離子未經過反射作用及較短的飛行距離可能更好地保留大分子的高聚物，但其形成的分子離子峰較寬，分辨率較低，無法分辨同位素峰。

圖5 牛血清白蛋白的質譜圖

5 結 語

為開拓學生的專業視野，我系將新型大型儀器有機質譜儀MALDI-TOF MS加入到研究生的儀器分析實驗課程中。根據樣品的性質和分子量范圍，本實驗選擇兩種代表性樣品聚乙二醇5000和牛血清白蛋白(66 KD)展開實驗進行MALDI質譜分析。

綜上所述, 本實驗過程中，學生可以自主使用MALDI-TOF質譜大型儀器對樣品進行測試分析，需要針對樣品的性質選擇不同的基質，根據樣品所處質量范圍利用不同檢測模式，了解反射模式具有分辨率高而線性模式具有靈敏度高的特點。使他們有效地掌握了相關測試手段，也讓大型儀器全面支撐研究生教學，進一步提高了分析儀器的利用率。本實驗的設計提出基于科研工作，實驗條件簡單，涉及有機化學、生物化學、物理知識等多方面內容，將科研與教學有機結合，能夠使學生充分了解科學研究的基本步驟及過程，開拓專業視野及培養創新思維具有重要意義[16]。能夠有效提高學生的科研興趣，為他們今后從事科學研究工作奠定良好的基礎，培養更多技術型人才。

[1] Liang Li. MALDI mass spectrometry for synthetic polymer analysis [M]. Canada, John Wiley & Sons, Inc., 2010.

[2] 周新文，金 紅，楊芃原. 基于MALDI源生物質譜技術平臺的建立[J]. 實驗室研究與探索, 2011, 30 (11): 398-401.

[3] Dai H, Zhang X Q, Harasymow S,etal. MALDI-TOF mass spectrometry provides an efficient approach to monitoring protein modification in the malting process[J]. International Journal of Mass Spectrometry, 2014, 371:8-16.

[4] Walterova Z, Horsko J. Quantification in MALDI-TOF mass spectrometry of modified polymers.[J]. Anal Chim Acta, 2011, 693(1-2):82-88.

[5] Panda A, Ghosh A K, Mirdha B R,etal. MALDI-TOF mass spectrometry for rapid identification of clinical fungal isolates based on ribosomal protein biomarkers[J]. Journal of Microbiological Methods, 2015, 109:93-105.

[6] Yun M, Feng T, Yan S G,etal. High-throughput genotyping of single-nucleotide polymorphisms in ace-1 gene of mosquitoes using MALDI-TOF mass spectrometry.[J]. Insect Science, 2013, 20(2):167-174.

[7] Agustini B C, Silva L P, Jr B C,etal. Evaluation of MALDI-TOF mass spectrometry for identification of environmental yeasts and development of supplementary database.[J]. Appl Microbiol Biotechnol, 2014, 98(12):5645-5654.

[8] Levchenko S M, Rebriev A V, Tkachuk V V,etal. Studies on interaction of oligoadenylates with proteins in vitro by MALDI-TOF mass spectrometry[J]. Biopolymers & Cell, 2013, 29(1):42-48.

[9] Kirschhofer F, Rieder A, Prechtl C,etal. Quartz crystal microbalance with dissipation coupled to on-chip MALDI-ToF mass spectrometry as a tool for characterising proteinaceous conditioning films on functionalised surfaces.[J]. Analytica Chimica Acta, 2013, 802:95-102.

[10] Sophie M. Frohlich, Victoria Dorrer, Vasiliki-Maria Archodoulaki,etal. Synovial fluid protein adsorption on polymer-based artificial hip joint material investigated by MALDI-TOF mass spectrometry imaging[J]. Eupa Open Proteomics, 2014:70-80.

[11] Almasoud N, Yun X, Nicolaou N,etal. Optimization of matrix assisted desorption/ionization time of flight mass spectrometry (MALDI-TOF-MS) for the characterization of Bacillus and Brevibacillus species.[J]. Analytica Chimica Acta, 2014, 840(1):49-57.

[12] Karas M, Gluckmann M, Schafer J. Ionization in matrix-assisted laser desorption /ionization: singly charged molecular ions are the lucky survivors [J]. J Mass Spectrom., 2000, 35(1): 1-12.

[13] 韓云海，吳煥周，丁曉玲. 化學探索性實驗的教學過程設計[J]. 實驗室研究與探索, 2007, 26 (1)：148-150.

[14] Vertes A, Levine R D, Sublimation versus fragmentation in matrix-assisted laser desorption [J]. Chemical Physics Letters, 1990,171(4): 284-290.

[15] 周海超，林益明，柴緯明. 反射模式與線性模式MALDI-TOF MS聯合分析荔枝果核縮合單寧[J]. 化學學報, 2011, 69(24): 2981-2986.

[16] 岑衛健，朱平川. 基于雙向電泳-MALDI質譜分析的蛋白組學本科教學實驗[J]. 實驗科學與技術，2014，12(2): 35-37.

Experiments Teaching on MALDI-TOF MS Analysis of PEG5000 and BSA

LIUYa-qin,ZOUJian-kai,QIUYa-yu

(Department of Chemistry, Zhejiang University, Hangzhou, 310027, China)

Matrix assisted laser desorption ionization time of flight mass spectrometry (MALDI-TOF MS) is one of the new type of precision instruments in mass spectrometric analysis. Through teaching experiment of MALDI-TOF mass spectrometry, the professional vision of students is widened effectively. According to the property of samples, different matrices and detection models are selected. In this paper, the samples of polyethylene glycol 5000 and bovine serum albumin (66KD) were taken as typical examples, the 2, 5-dihydroxybenzoic acid is selected as a matrix of polyethylene glycol 5000, while sinapinic acid as the matrix of bovine serum albumin for mass spectrometric detection. It made students understand the properties and application of the MALDI instrument, and made a good foundation for their future engaged in scientific research. Furthermore, the precision instruments supporting graduate teaching were revealed, by which the utilization rate of analysis instrument was also improved.

MALDI mass spectrometry； bovine serum albumin; experiment teaching; large-scale precision instruments

2014-11-03

浙江省科技廳公益性技術應用研究計劃項目(2015C37007)；浙江大學資助項目(SYB201402)

劉雅琴(1981-)，女，湖北十堰人，博士，助理研究員，主要從事MALDI質譜和核磁共振研究。

Tel.：13777850547，0571-87951264；E-mail：yaqin86@zju.edu.cn

O 657.63；G 642.0

A

1006-7167(2015)10-0183-04