表沒食子兒茶素沒食子酸酯通過調控P53/miR-34a抑制鼻咽癌細胞的增殖*

李彬彬，萬　鄭，孔　霞，廖　丹，王籽又，黃國良△(廣東醫學院病理生理學教研室，廣東省醫學分子診斷重點實驗室，廣東東莞53808)

表沒食子兒茶素沒食子酸酯通過調控P53/miR-34a抑制鼻咽癌細胞的增殖*

李彬彬1，2，萬鄭2，孔霞1，廖丹1，王籽又1，黃國良2△
(廣東醫學院1病理生理學教研室，2廣東省醫學分子診斷重點實驗室，廣東東莞523808)

［摘要］目的:觀察表沒食子兒茶素沒食子酸酯(EGCG)對鼻咽癌細胞增殖的影響，并以微小RNA-34a (miR-34a)為靶點探討其作用機制。方法:不同濃度的EGCG處理CNE-2Z細胞，CCK-8法、EdU染色法和平板克隆形成實驗檢測細胞增殖能力的改變;流式細胞術檢測細胞周期分布的改變; Western blot檢測P53和Notch1蛋白水平的變化; real-time PCR檢測miR-34a和Notch1 mRNA的表達。結果: EGCG處理后，CNE-2Z細胞的增殖受到明顯抑制，克隆形成能力降低，細胞周期阻滯于G0/G1期，呈劑量依賴關系;隨著EGCG濃度增高，P53和miR-34a的表達水平明顯上調，而其下游Notch1 mRNA和蛋白的表達水平則明顯下降。結論: EGCG可能通過調控P53/miR-34a/Notch1通路誘導細胞周期阻滯，抑制鼻咽癌細胞增殖。

［關鍵詞］表沒食子兒茶素沒食子酸酯;鼻咽癌; P53;微小RNA-34a; Notch1

［修回日期］2015-05-21

△通迅作者Tel: 0769-22896402; E-mail: 44775879@qq.com

鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma，NPC)是高發于我國南方地區和東南亞國家的惡性腫瘤之一。該腫瘤原發部位隱蔽，不易早期發現，惡性程度較高，易呈浸潤性生長及早期轉移。放射治療是鼻咽癌的主要治療手段，但單一放療手段治療中晚期鼻咽癌病例，5～10年生存率僅有40%左右。因此，尋找有效低毒的天然藥物或綜合治療方案，并探討其作用機制，對于提高鼻咽癌的臨床療效及預后，改善患者生活質量有著重要意義。

表沒食子兒茶素沒食子酸酯［(－) -epigallocatechin-3-gallate，EGCG］是綠茶中含量最高和最具有藥用功效的活性成分。近年來，EGCG在腫瘤預防及抗腫瘤活性上展現了很好的前景。體內動物實驗和體外細胞實驗等均發現EGCG對肺癌、宮頸癌、胃癌、結腸癌、肝癌和鼻咽癌等多種腫瘤的發生、發展有抑制作用。Ruan等［1］對我國廣東省兩千多名個體進行病例對照研究，發現喝茶與較低的鼻咽癌發病風險相關。近年來研究顯示，多種微小RNA(microRNA，miRNA)發揮腫瘤抑制因子或致癌因子的作用，參與調控腫瘤細胞增殖、凋亡、黏附和血管生成等多個生物學過程，有望成為腫瘤治療的新靶點［2］。本研究旨在觀察EGCG對鼻咽癌細胞株CNE-2Z增殖和細胞周期的影響，并以miRNA-34a為靶點，探討其作用機制。

材料和方法

1主要試劑

EGCG購自Sigma，由PBS配成1 g/L，－20℃避光保存; CCK-8試劑盒購自Dojindo; EdU試劑盒購自廣州銳博生物科技公司; TRIzol試劑購自Invitrogen; real-time PCR相關試劑購自Promega; FS Universal SYBR Green Master購自Roche;兔抗人P53多抗購自Cell Signaling;兔抗人Notch1多抗和鼠抗人β-actin單抗購自Santa Cruz;紅外標記羊抗兔和羊抗鼠Ⅱ抗購自Rockland。

2方法

2.1細胞培養人低分化鼻咽癌細胞株CNE-2Z為本實驗室保存，采用RPMI-1640培養基(含10%胎牛血清，1×105U/L青霉素，100 mg/L鏈霉素)在37℃、5% CO2培養箱中培養。

2.2CCK-8法檢測細胞活性取對數生長期CNE-2Z細胞，以3 000 cells/well接種到96孔板，培養24 h后換含不同濃度(10和20 μmol/L) EGCG的RPMI-1640培養基(含2%胎牛血清)處理，每組設5個平行孔;分別于24 h、48 h和72 h在每孔加入CCK-8工作液100 μL(含10 μL CCK-8溶液)，繼續培養2 h，在多功能酶標儀上測定450 nm波長各孔光吸收值(A值)，計算細胞抑制率。細胞抑制率(%)=(對照組A值－實驗組A值)/對照組A值×100%。

2.3EdU摻入法檢測細胞增殖取對數生長期CNE-2Z細胞，以3 000 cells/well接種到96孔板，培養24 h后換含不同濃度(10和20 μmol/L) EGCG的RPMI-1640培養基(含2%胎牛血清)繼續培養24 h，每組設3個平行孔;加入終質量濃度為50 μmol/L的EdU，繼續培養2 h;加入4%多聚甲醛固定30 min，0.5% Triton X-100室溫孵育20 min;加入1×Apollo反應液100 μL避光孵育30 min，再加入5 mg/L Hoechst 33342避光孵育30 min; PBS清洗后，熒光顯微鏡下采集圖像。藍色為細胞核，紅色為EdU標記處于增殖期的細胞，細胞增殖率=增殖細胞數/總細胞數×100%。

2.4平板克隆形成實驗檢測細胞克隆形成能力取對數生長期CNE-2Z細胞，以400 cells/well接種到6孔板，培養24 h后給予不同濃度(5和10 μmol/L) EGCG處理，每組設3個平行孔，連續培養約2周;用PBS清洗細胞2次，甲醇固定15 min后，0.4%結晶紫染色15 min，流水沖洗;將平皿倒置并疊加一張帶網格的透明膠片，直接計數克隆數。

2.5流式細胞儀檢測細胞周期分布取對數生長期CNE-2Z細胞接種于6孔板，待細胞長至60%～70%滿度后換無血清培養基培養24 h，使細胞周期同步化;再給予不同濃度(10和20 μmol/L) EGCG處理24 h，每組設3個平行孔;收集細胞，加入預冷的70%乙醇固定，4℃過夜;離心后加入終濃度為100 mg/L RNase和100 mg/L PI染色液400 μL，混勻，室溫避光染色30 min;采用BD FACSCantoⅡ流式細胞儀進行檢測分析。

2.6Western blot檢測P53和Notch1的蛋白表達不同濃度的EGCG(10和20 μmol/L)處理CNE-2Z細胞24 h后，加入細胞裂解液提取總蛋白;采用BCA法測定蛋白濃度后加入等量蛋白樣品進行10% SDS-PAGE凝膠電泳，將凝膠中的蛋白轉移到PVDF膜上，5%脫脂奶粉封閉2 h;加入I抗［P53抗體和Notch1抗體(1∶500)］，4℃孵育過夜;加入紅外標記的II抗(1∶10 000)，室溫孵育2 h; Odyssey近紅外雙色激光成像系統掃描成像，Quantity One軟件進行條帶灰度分析。以β-actin作為內參照。

2.7Real-time PCR檢測miR-34a和Notch1 mRNA表達不同濃度的EGCG(10和20 μmol/L)處理CNE-2Z細胞24 h后，TRIzol提取總RNA。采用帶莖環結構的miR-34a特異性逆轉錄引物進行逆轉錄反應合成cDNA;以cDNA為模板，采用SYBR GreenⅠ嵌合熒光法在ABI 7500實時定量PCR儀進行PCR反應，以U6 RNA作為內參照;引物購自廣州銳博生物科技有限公司。采用Oligo(dT)引物進行逆轉錄反應合成cDNA;以cDNA為模板，real-time PCR反應檢測Notch1 mRNA表達的上游引物為5’-GTCAACGCCGTAGATGACCT-3’，下游引物為5’-TCTCCTCCCTGTTGTTCTGC-3’，以GAPDH作為內參照;引物由上海生工生物工程有限公司合成。所有標本均重復3次，計算出Ct值，采用2－ΔΔCt法進行計算分析。

3統計學處理

應用SPSS 17.0及GraphPad Prism統計學軟件處理和分析實驗數據。計量資料采用均數±標準差(mean±SD)表示，兩組間比較采用t檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

結果

1 CCK-8法檢測EGCG對CNE-2Z細胞活性的影響

在預實驗中，給予不同濃度的EGCG(5、10、20、40和80μmol/L)作用CNE-2Z細胞24 h，CCK-8結果顯示，隨著濃度的增加，EGCG對CNE-2Z細胞活性的抑制作用逐漸增強，其IC50為33.82 μmol/L。在此基礎上，采用10 μmol/L和20 μmol/L EGCG作用CNE-2Z細胞不同時間(24 h、48 h和72 h)，結果如圖1所示，隨藥物濃度的增加和作用時間的延長，細胞活性的抑制率逐漸增加，具有明顯的劑量和時間效應關系。

Figure 1.The effect of EGCG on the viability in CNE-2Z cells detected by CCK-8 assay.Mean±SD.n=3.圖1 EGCG對CNE-2Z細胞活性的影響

2 EdU摻入法檢測EGCG對CNE-2Z細胞增殖的影響

與對照組相比，EGCG處理24 h組中EdU陽性的細胞明顯減少，且呈劑量依賴關系，提示EGCG可以減少處于增殖期的細胞，具有抑制CNE-2Z細胞增殖的作用，見圖2。

3 EGCG對CNE-2Z細胞克隆形成能力的影響

與對照組相比，5 μmol/L EGCG即可明顯抑制CNE-2Z細胞的克隆形成能力，其克隆形成數目和克隆形成大小均減少(P＜0.05)。隨著EGCG濃度的增加，其抑制作用更加明顯，見圖3。

4 EGCG對CNE-2Z細胞周期的影響

圖4所示，與對照組相比，EGCG能誘導G0/G1期細胞的百分率增加，而S期細胞的百分率減少，呈劑量依賴性，提示EGCG能將CNE-2Z細胞周期阻滯于G0/G1期。

5 EGCG對CNE-2Z細胞P53表達的影響

Western blot實驗結果顯示，與對照組相比，隨著濃度的增加，EGCG能明顯提高P53蛋白的表達水平，呈劑量依賴關系，見圖5。

6 EGCG對CNE-2Z細胞miR-34a表達的影響

Real-time PCR結果顯示，EGCG能明顯上調miR-34a的表達，并具有濃度依賴性，見圖6。

7 EGCG對CNE-2Z細胞Notch1 mRNA和蛋白表達的影響

Real-time PCR和Western blot實驗結果顯示，與對照組相比，EGCG能明顯抑制Notch1的mRNA和蛋白表達，呈劑量依賴性，見圖7。

Figure 2.The results of EdU assay showed that EGCG inhibited the proliferation of CNE-2Z cells.Mean±SD.n=3.*P＜0.05，＊＊P＜0.01 vs 0 μmol/L.圖2 EGCG對CNE-2Z細胞增殖的抑制作用

Figure 3.EGCG suppressed colony formation of CNE-2Z cells.Mean±SD.n=3.*P＜0.05，＊＊P＜0.01 vs 0 μmol/L.圖3 EGCG抑制CNE-2Z細胞的克隆形成能力

討論

綠茶為中華民族的傳統保健飲料，幾乎無毒副作用，其水溶性提取物含有多種多酚類化合物，其中EGCG的含量最高，也最具有藥用功效。大量研究顯示［3］，EGCG可通過抑制細胞增殖、誘導細胞凋亡、調節細胞代謝中關鍵酶活性、抑制腫瘤細胞的侵襲和轉移以及調節腫瘤血管形成等多種機制發揮抗腫瘤作用。EGCG也發現能夠提高機體免疫功能及增強腫瘤細胞對放療的敏感性［4］。本研究應用不同濃度的EGCG處理鼻咽癌細胞CNE-2Z后，CCK-8法檢測顯示細胞生長受到明顯抑制，呈現劑量和時間效應關系; EdU摻入法檢測顯示隨著EGCG濃度的增加，EdU標記細胞的比例逐漸減少，表明EGCG具有抑制鼻咽癌細胞增殖的作用。此外，EGCG亦能明顯地降低CNE-2Z細胞的克隆形成能力。流式細胞術檢測發現，EGCG能將CNE-2Z細胞周期阻滯在G0/G1期，不能進入S期，這可能是EGCG抑制鼻咽癌細胞增殖的重要機制。

Figure 4.The effect of EGCG on the cell cycle distributions in CNE-2Z cells.Mean±SD.n=3.*P＜0.05，＊＊P＜0.01 vs control group.圖4 EGCG對CNE-2Z細胞周期分布的影響

miRNA是真核生物體內一類具有調控功能的非編碼RNA，長約19～25個核苷酸，在胞質中通過堿基互補配對結合到下游靶基因mRNA的3’UTR區域，抑制mRNA的翻譯甚至促使其降解，進而調控靶基因的表達。近年來研究發現，miRNA表達或調控異常與人類多種腫瘤相關。miRNA參與調控重要腫瘤相關基因，發揮腫瘤抑制基因或者癌基因的功能，在腫瘤的發生發展過程中起重要作用。miR-34a是miR-34家族的成員之一，其基因位于人染色體的1p36.23，這一位點常伴隨多個基因的缺失或突變，與腫瘤的發生密切相關。目前多數研究認為miR-34a在多種腫瘤中承擔抑制因子的作用，外源性表達miR-34a可通過調控細胞周期阻滯、誘導細胞凋亡和抑制細胞侵襲和轉移等降低腫瘤細胞的惡性程度［5-6］。在神經母細胞瘤、前列腺癌、胃癌及非小細胞肺癌等中均發現有miR-34a的低表達或表達缺失，參與腫瘤的發生和進展過程［5，7］。p53作為最重要的抑癌基因，它的突變和缺失在多種腫瘤包括鼻咽癌中是一個最為常見的生物學事件。體內和體外的實驗均表明，miR-34a是p53直接轉錄靶標，在腫瘤應激和DNA損傷的情況下，miR-34a通過p53依賴的方式誘導表達［8］。在多種腫瘤如慢性淋巴細胞白血病、前列腺癌及胃癌等中，均發現p53的缺失或突變伴隨有miR-34a表達水平的下調［9-10］。在前期工作中，我們采用Agilent公司的Human miRNA V16.0芯片，檢測EGCG對CNE-2 Z細胞中miRNA表達譜的影響，發現miR-34a表達是明顯上調的。采用實時定量PCR進行驗證也顯示，EGCG可上調CNE-2Z細胞中miR-34a的表達，呈劑量依賴性。同時，本研究也發現，隨著EGCG濃度增加，P53蛋白的表達也明顯增高，這可能與EGCG調控P53蛋白穩定性增強進而上調P53表達有關［11］。這些結果提示，EGCG可能通過促進P53/miR-34a表達調控鼻咽癌CNE-2Z細胞G1期阻滯，并誘導細胞凋亡，但其確切的交互關系尚需進一步研究闡明。

Notch1是Notch基因編碼的蛋白家族成員之一，它是一種跨膜受體蛋白，通過與相應的配體結合在多種細胞分化發育中起重要的調控作用［12］。近年來研究發現，Notch1信號傳導異常與多種腫瘤的發生發展密切相關。在一些腫瘤中如膠質瘤、胰腺癌和結直腸癌中，Notch1被認為作為癌基因起作用，通過影響細胞周期相關蛋白如cyclin D1、cyclin E、CDK2、p27等參與細胞周期調控，進而促進細胞增殖［13-14］。通過生物信息學軟件預測發現，miR-34a與Notch1 的3'UTR高度同源配對，螢光素酶實驗也證實了miR-34a對Notch1基因的直接調控作用［15］。我們應用不同濃度的EGCG處理鼻咽癌CNE-2Z細胞后，發現與對照組相比，Notch1的mRNA和蛋白表達水平均是明顯下降的，呈劑量依賴關系，這就提示EGCG可能通過降低Notch1表達抑制鼻咽癌細胞的增殖，而其作用機制可能與EGCG上調P53/miR-34a有關。但亦有研究顯示Notch1與P53之間存在直接相互關系，Notch1通過影響P53蛋白穩定性進而抑制P53介導的細胞凋亡反應［16］。

Figure 5.The effect of EGCG on the expression of P53 in the CNE-2Z cells by Western blot.Mean±SD.n=3.*P＜0.05 vs 0 μmol/L.圖5 EGCG對CNE-2Z細胞P53表達的影響

Figure 6.The effect of EGCG on the expression of miR-34a in the CNE-2Z cells.Mean±SD.n=3.*P＜0.05 vs 0 μmol/L.圖6 EGCG對CNE-2Z細胞miR-34a表達的影響

Figure 7.The effect of EGCG on the expression of Notch1 atmRNA and protein levels in the CNE-2Z cells.Mean±SD.n=3.*P＜0.05，＊＊P＜0.01 vs 0 μmol/L.圖7 EGCG對CNE-2Z細胞Notch1 mRNA和蛋白表達的影響

綜上所述，EGCG可能通過調控P53/miR-34a/Notch1通路誘導鼻咽癌細胞周期阻滯，抑制細胞增殖，將為EGCG在鼻咽癌防治中的應用提供理論依據。

［參考文獻］

［1］Ruan HL，Xu FH，Liu WS，et al.Alcohol and tea consumption in relation to the risk of nasopharyngeal carcinoma in Guangdong，China［J］.Front Med China，2010，4 (4) : 448-456.

［2］Farazi TA，Spitzer JI，Morozov P，et al.miRNAs in human cancer［J］.J Pathol，2011，223(2) : 102-115.

［3］Singh BN，Shankar S，Srivastava RK.Green tea catechin，epigallocatechin-3-gallate (EGCG) : mechanisms，perspectives and clinical applications［J］.Biochem Pharmacol，2011，82(12) : 1807-1821.

［4］Lecumberri E，Dupertuis YM，Miralbell R，et al.Green tea polyphenol epigallocatechin-3-gallate (EGCG) as adjuvant in cancer therapy［J］.Clin Nutr，2013，32(6) : 894-903.

［5］Chen WY，Stallings RL.MicroRNA-34a functions as a potential tumor suppressor by inducing apoptosis in neuroblastoma cells［J］.Oncogene，2007，26 (34) : 5017-5022.

［6］Li L.Regulatory mechanisms and clinical perspectives of miR-34a in cancer［J］.J Cancer Res Ther，2014，10(4) : 805-810.

［7］Shi Y，Liu C，Liu X，et al.The microRNA miR-34a inhibits non-small cell lung cancer (NSCLC) growth and the CD44histem-like NSCLC cells［J］.PLoS One，2014，9 (3) : e90022.

［8］He L，He X，Lim LP，et al.A microRNA component of the p53 tumour suppressor network［J］.Nature，2007，447(7148) : 1130-1134.

［9］Ji Q，Hao XB，Meng Y，et al.Restoration of tumor miR-34 inhibits human p53-mutant gastric cancer tumorspheres ［J］.BMC Cancer，2008，8: 266.

［10］Dijkstral MK，van Loml K，Tielemans D，et a1.17p13/TP53 deletion in B-GLL patients is associated with microRNA-34a downregulation［J］.Leukemia，2009，231 (3) : 625-627.

［11］Jin L，Li C，Xu Y，et a1.Epigallocatechin gallate promotes p53 accumulation and activity via the inhibition of MDM2-mediated p53 ubiquitination in human lung cancer cells［J］.Oncol Rep，2013，29(5) : 1983-1990.

［12］Lai EC.Notch signaling: control of cell communication and cell fate［J］.Development，2004，131(5) : 965-973.

［13］Zhang XP，Zheng G，Zou L，et al.Notch activation promotes cell proliferation and the formation of neural stem cell-like colonies in human glioma cell［J］.Mol Cell Biochem，2008，307(1-2) : 101-108.

［14］Gopalakrishnan N，Saravanakumar M，Madankumar P，et al.Colocalization of β-catenin with Notch intracellular domain in colon cancer: a possible role of Notch1 signaling in activation of CyclinD1-mediated cell proliferation［J］.Mol Cell Biochem，2014，396(1-2) : 281-293.

［15］Li Y，Guessous F，Zhang Y，et al.MicroRNA-34a inhibits glioblastoma growth by targeting multiple oncogenes ［J］.Cancer Res，2009，69(19) : 7569-7576.

［16］Licciulli S，Avila JL，Hanlon L，et al.Notch1 is required for Kras-induced lung adenocarcinoma and controls tumor cell survival via p53［J］.Cancer Res，2013，73(19) : 5974-5984.

(責任編輯:林白霜，羅森)

Inhibitory role of epigallocatechin-3-gallate in proliferation of human nasopharyngeal carcinoma cells by targeting P53/miR-34a

LI Bin-bin1，2，WAN Zheng2，KONG Xia1，LIAO Dan1，WANG Zi-you1，HUANG Guoliang2
(1Department of Pathophysiology，2Key Laboratory for Medical Diagnostics of Guangdong Province，Guangdong Medical College，Dongguan 523808，China.E-mail: 44775879@qq.com)

［ABSTRACT］AIM: To study the effect of epigallocatechin-3-gallate (EGCG) on the proliferation of human nasopharyngeal carcinoma (NPC) cells，and to explore its mechanism by targeting miR-34a.METHODS: Nasopharyngeal carcinoma CNE-2Z cells were treated with various concentrations of EGCG.The ability of cell proliferation was detected by CCK-8 assay，5-ethynyl-2-deoxyuridine (EdU) incorporation assay and colony-forming assay.The cell cycle distributions were analyzed by flow cytometry.The protein levels of P53 and Notch1 were detected by Western blot.The expression of miR-34a and Notch1 mRNA was measured by real-time PCR.RESULTS: EGCG effectively inhibited the proliferation and colony formation of CNE-2Z cells in a dose-dependent manner，which was related to its induction of cell cycle arrest at G0/G1phase.The expression of P53 and miR-34a in CNE-2Z cells was significantly increased after treated with EGCG，while the expression of Notch1 at mRNA and protein levels was markedly suppressed.CONCLUSION: EGCG induces cell cycle arrest and suppresses cell proliferation by regulating the P53/miR-34a/Notch1 pathway in NPC cells.

［KEY WORDS］Epigallocatechin-3-gallate; Nasopharyngeal carcinoma; P53; MicroRNA-34a; Notch1

*［基金項目］廣東省建設中醫藥強省科研課題(No.20121111)

［收稿日期］2015-03-17

［文章編號］1000-4718(2015)09-1557-06

［中圖分類號］R739.6; R730.23

［文獻標志碼］A

doi:10.3969/j.issn.1000-4718.2015.09.004