慢病毒介導的RWDD3沉默對人膠質瘤U251細胞增殖和侵襲的影響*

范陽華，祝新根，呂世剛，吳淼經，柴　毅，葉敏華，肖　兵，吳　雷(南昌大學第二附屬醫院神經外科，江西南昌330006)

慢病毒介導的RWDD3沉默對人膠質瘤U251細胞增殖和侵襲的影響*

范陽華，祝新根，呂世剛，吳淼經，柴毅，葉敏華，肖兵，吳雷△
(南昌大學第二附屬醫院神經外科，江西南昌330006)

［摘要］目的:探討沉默RWDD3表達對人膠質瘤U251細胞生物學特征的影響。方法:構建靶向RWDD3 的shRNA重組慢病毒并轉染U251細胞，通過real-time PCR和Western blot在mRNA及蛋白水平鑒定轉染結果。MTT法檢測轉染后細胞的細胞活力;平板克隆實驗檢測克隆形成能力; BrdU實驗檢測細胞增殖能力; Transwell實驗檢測細胞遷移和侵襲能力的變化;流式細胞術檢測細胞周期及細胞凋亡的改變。結果: real-time PCR和Western blot結果均表明成功建立穩定沉默RWDD3的U251細胞株。與空白對照組及陰性對照組比較，轉染RWDD3-shRNA組的細胞活力和克隆形成能力降低;侵襲及遷移能力均下降，穿膜細胞數明顯減少;細胞周期進展被抑制，阻滯于G0/G1期，細胞凋亡率增高(P＜0.05)。結論: RWDD3在膠質瘤細胞增殖和侵襲過程中發揮重要作用，提示RWDD3有望成為人腦膠質瘤基因治療的候選靶點。

［關鍵詞］膠質瘤; RWDD3;慢病毒;增殖;侵襲

［修回日期］2015-06-19

腦膠質瘤是中樞神經系統最常見的原發性腫瘤，具有無控性增殖、侵襲性生長、易復發的特點［1-2］。其本質上是一種多基因異常疾病，由于原癌基因的過表達，同時伴隨抑癌基因的突變缺失，從而使腫瘤細胞逃避了正常生長的調控機制。

RWDD3是一種最初在垂體腺瘤中發現的蛋白，可能調節HIF-1α/VEGF通路并與腫瘤的血管生成、生長、轉移等惡性進展密切相關［3］。但其在腦膠質瘤中的作用及機制尚不明確。我們的前期研究表明，RWDD3在腦膠質瘤組織中高表達，但尚未檢索到RWDD3在人腦膠質瘤生長過程中作用的相關研究報道。本實驗采用前期研究中篩選出來的針對RWDD3干擾效果最好的靶點序列構建shRNA表達載體，通過慢病毒介導的方法轉染人腦膠質瘤U251細胞，檢測人腦膠質瘤細胞系的侵襲、增殖等生物學表型的變化，以探討RWDD3對人腦膠質瘤細胞生長的影響。

材料和方法

1主要材料和試劑

人膠質瘤細胞株U251細胞為本實驗室保存;慢病毒載體GV248及慢病毒包裝系統Lentivector Packaging Kit購自上海吉凱基因化學公司。轉染試劑Lipofectamine 2000和RNA抽提試劑TRIzol購自Invitrogen; cDNA逆轉錄試劑盒和real-time PCR試劑盒購自TaKaRa; BCA蛋白質定量試劑盒、細胞總蛋白抽提試劑盒以及兔抗人RWDD3、β-actin多抗購自Abcam;細胞培養所用的DMEM購自Gibco。Transwell板購自Corning。FACSCalibur流式細胞儀(BD)。

2主要方法

2.1構建慢病毒載體與細胞感染根據我們前期實驗結果中，設計針對RWDD3的3個siRNA靶點序列，篩選出針對RWDD3干擾效果最好的靶點序列為5’-GATGATGGATTGTGGATAA-3’，合成表達shRNA 的2條互補DNA單鏈，上述單鏈退火形成雙鏈，連接到線性化載體GV248后轉化DH5α感受態細胞，提取質粒進行酶切鑒定并測序。再用293T細胞包裝病毒。感染前取對數生長期的U251細胞接種于6孔細胞培養板中，每孔5×104個細胞;使用不含抗生素的含10%胎牛血清的DMEM培養基，37℃、5% CO2條件下培養。同時制備空載體作為對照(由上海吉凱基因化學公司完成)，并將實驗分為空白對照(blank)組、空載體(NC-shRNA)組和轉染(RWDD3-shRNA)組。

2.2Real-time PCR檢測U251細胞中RWDD3的mRNA表達用TRIzol提取細胞總RNA，逆轉錄試劑盒合成cDNA。以real-time PCR檢測各組RWDD3 mRNA的表達量。總反應體系20 μL，其中SYBR Premix Ex Taq 10 μL，上、下游引物各0.5 μL(2.5 μmol/L)，cDNA模板1 μL，RNase-free H2O加至20 μL。反應條件: 95℃2 min; 95℃30 s，58.8℃30 s，72℃30 s，共40個循環; 72℃5 min。RWDD3基因的上游引物為5’-TACCTGGTATCTCGATTAACTCTGAAC-3’，下游引物為5’-TCAGTATTATTTTACCCATGAACATCA-3’; GAPDH的上游引物為5’-GTTGGAGGTCGGAGTCAACGG-3’，下游引物為5’-GAGGGATCTCGCTCCTGGAGGA-3’。整個反應過程中熒光信號的變化由real-time PCR儀監測。反應結束后，電腦自動分析并顯示計算結果，2－ΔΔCt法計算RWDD3的mRNA相對表達量。

2.3Western blot法檢測U251細胞中RWDD3蛋白的表達1 000 r/min離心5 min收集細胞，棄上清，根據細胞量加入相應的提取緩沖液，收集裂解液，BCA法測定蛋白濃度，80 mV電壓下在10% SDSPAGE 2 h。PVDF膜在250 mA下轉膜70 min。5%脫脂奶粉封閉液中室溫下封閉2 h或4℃過夜封閉，TBST洗膜3次。加入RWDD3(1∶800稀釋)、β-actin (1∶5 000稀釋) I抗，4℃過夜孵育;洗膜3次后加入II抗(1∶5 000稀釋)室溫孵育2 h，TBST洗膜10 min 3次，置增強化學發光試劑ECL底物中反應5 min，暗室曝光顯示特異的蛋白信號，依據ECL化學發光試劑盒操作說明進行顯影、定影。利用凝膠圖像分析系統對膠片進行灰度掃描和凈吸光度值分析。

2.4MTT實驗檢測U251細胞活力將轉染后24 h的細胞按2×103細胞(每孔100 μL)接種到96孔板，分別于接種后1 d、2 d、3 d、4 d、5 d進行MTT檢測，每孔中加入MTT溶液20 μL(5 g/L)。37℃條件下培養4 h，棄上清，每孔加二甲基亞砜150 μL，振蕩20 min，紫外分光光度計570 nm波長測各孔吸光度值，每組設5個復孔。

2.5平板克隆形成實驗檢測U251細胞增殖活性將轉染后24 h的細胞按2×102細胞接種到6孔板，輕輕轉動使細胞分散均勻。置細胞培養箱中培養2周，PBS小心浸洗2次，然后用95%乙醇固定10 min，風干;用0.1%結晶紫染色10 min，自來水沖洗3次，空氣干燥。計數大于30個細胞的克隆數。

2.6BrdU實驗檢測U251細胞增殖活性轉染后24 h的細胞按2×104細胞接種于6孔板，培養24 h后，加入10 μmol/L的BrdU，繼續培養24 h，吸除細胞培養液，用PBS洗滌2次，40 g/L多聚甲醛固定30 min，PBS沖洗3次，2 mol/L鹽酸作用40 min，血清封閉后加入抗BrdU抗體，4℃過夜，室溫復溫后加入羅丹明標記的熒光Ⅱ抗，DAPI復染后，任取5個視野計數BrdU陽性細胞數量，并進行統計學分析。

2.7Transwell實驗檢測轉染后U251細胞侵襲和遷移能力的變化轉染48 h后在Transwell上室中加入1∶2(基質膠: DMEM)稀釋后的基質膠60 μL，37 ℃30 min使其聚合成凝膠。在下室中加入細胞條件培養液600 μL。待檢細胞用無血清培養基制成單細胞懸液，上室中加入1×105個細胞，24 h后棄上室液體，擦去Transwell小室上室面未穿過膜的細胞，甲醇固定30 min風干后用0.1%的結晶紫染色20 min。200倍下計數上、中、下、左、右5個視野中黏附細胞數，計算平均值。每組設4個復孔，以上所有實驗均重復3次。細胞遷移實驗同侵襲實驗，只是Transwell小室上室面不鋪Matrigel，其余方法同上。

2.8流式細胞儀分析細胞周期分布75%乙醇、4℃固定消化好的單細胞懸液過夜，RNase A(1 g/L) 200 μL，37℃孵育30 min，與800 μL碘化丙啶染色液混勻后，4℃避光染色30 min，使用FACSCalibur流式細胞儀檢測。

2.9流式細胞術分析細胞凋亡將上述病毒感染細胞。待細胞密度為80%時將細胞消化成單細胞懸液，1 500 r/min 5 min離心，棄上清，PBS洗滌細胞沉淀，1 500 r/min 5 min離心收集細胞: 1×binding buffer洗滌細胞沉淀1次，1 500 r/min 5 min離心，收集細胞; 1 mL 1×staining buffer重懸細胞沉淀;取細胞懸液100 μL，加入5 μL Annexin V-APC染色，室溫避光10～15 min后.轉移至流式細胞儀上機管中，上機檢測。

3統計學處理

所有實驗數據均經SPSS 20.0統計軟件分析。計量資料以均數±標準差(mean±SD)表示，比較采用單因素方差分析或重復測量的方差分析，進一步兩兩比較采用SNK-q檢驗;百分數的比較采用χ2檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

結果

1慢病毒載體轉染人腦膠質瘤U251細胞

RWDD3 shRNA感染人腦膠質瘤U251細胞48 h后，絕大多數細胞都熒光著色，與背景反差明顯，熒光著色細胞有明顯的細胞輪廓，見圖1。

Figure 1.The green fluorescence in the U251 cells transfected with RWDD3-shRNA after 48 h.圖1慢病毒載體轉染人腦膠質瘤U251細胞48 h后熒光表達的改變

2 Real-time PCR檢測轉染后細胞RWDD3的mRNA表達

與空白對照組和陰性對照組比較，RWDD3-sh-RNA組細胞RWDD3 mRNA的表達降低(P＜0.05) ;空白對照組與陰性對照組相比差異不顯著，見圖2。

Figure 2.The mRNA expression levels of RWDD3 in the U251 cells after transfection with RWDD3-shRNA detected by real-time PCR.Mean±SD.n=10.*P＜0.05 vs RWDD3-shRNA group.圖2 RWDD3-shRNA感染U251細胞對RWDD3 mRNA表達的影響

3 Western blot檢測轉染后細胞RWDD3的蛋白表達

與空白對照組和陰性對照組比較，RWDD3-shRNA組細胞RWDD3蛋白的表達降低(P＜0.05)，空白對照組與陰性對照組相比差異不顯著(P＞0.05)，見圖3。

Figure 3.The protein levels of RWDD3 in the U251 cells after transfection with RWDD3-shRNA detected by Western blotting.Mean±SD.n=10.*P＜0.05 vs RWDD3-shRNA group.圖3 RWDD3-shRNA感染U251細胞對RWDD3蛋白表達的影響

4平板克隆形成檢測細胞增殖和克隆形成能力

與空白對照組及陰性對照組比較，轉染RWDD3-shRNA組U251細胞的克隆形成能力明顯減弱(P＜0.05)，空白對照組與陰性對照組相比差異不顯著(P＞0.05)，見圖4。

5 MTT法檢測細胞活力的變化

與空白對照組及陰性對照組比較，轉染后24 h，轉染RWDD3-shRNA組U251細胞的細胞活力明顯減弱(P＜0.05)，空白對照組與陰性對照組相比差異不顯著，見圖5。本實驗結果與平板克隆形成實驗的結果相一致，間接反映了細胞增殖能力的變化。

Figure 4.The plate colony formation test showing the proliferation and colony formation ability of the U251cells after transfection with RWDD3-shRNA.Mean±SD.n=5.*P＜0.05 vs RWDD3-shRNA group.圖4平板克隆形成檢測轉染后U251細胞的增殖和克隆形成能力

Figure 5.The activity of the U251 cells after transfection with RWDD3-shRNA determined by MTT assay.Mean± SD.n=6.*P＜0.05 vs RWDD3-shRNA group.圖5 MTT檢測轉染后不同時間U251細胞活力的改變

6 BrdU實驗檢測細胞增殖能力

與空白對照組及陰性對照組比較，轉染后24 h，轉染RWDD3-shRNA組U251細胞的增殖能力明顯減弱(P＜0.05)，空白對照組與陰性對照組相比差異不顯著，見圖6。本實驗結果與平板克隆形成實驗、MTT實驗的結果相一致，直接反映了細胞增殖能力的變化。

Figure 6.The BrdU incorporation assay showing the proliferation ability of the U251 cells after transfection with RWDD3-shRNA (×200).Mean±SD.n=5.*P＜0.05 vs RWDD3-shRNA group.圖6 BrdU實驗檢測轉染后U251細胞的增殖能力

7 Transwell實驗檢測細胞的遷移能力和侵襲能力

與空白對照組及陰性對照組相比較，RWDD3-shRNA組穿膜細胞數明顯減少，差異有統計學意義(P＜0.05)，空白對照組與陰性對照組相比差異不顯著，見圖7、8。

Figure 7.The effects of RWDD3-shRNA transfection on the migration ability of the U251 cells.Mean±SD.n=5.*P＜0.05 vs RWDD3-shRNA group.圖7轉染RWDD3-shRNA對U251細胞遷移能力的影響

Figure 8.The effects of RWDD3-shRNA transfection on the invasion ability of the U251 cells.Mean±SD.n=5.*P＜0.05 vs RWDD3-shRNA group.圖8轉染RWDD3-shRNA對U251細胞侵襲能力的影響

8流式細胞術分析細胞周期和凋亡

空白對照組細胞G0/G1、S和G2/M期分別占54.28%、27.34%和18.38%，陰性對照組細胞G0/G1、S和G2/M期分別占56.67%、25.49%和17.84%，RWDD3-shRNA組細胞G0/G1、S和G2/M期分別占77.28%、14.28%和8.44%。與空白對照組和陰性對照組比較，RWDD3-shRNA組G0/G1期細胞比例增高(P＜0.05)，空白對照組與陰性對照組相比差異不顯著，見圖9。

利用流式細胞儀檢測轉染4 d后各組細胞的凋亡率，空白對照組的凋亡率為(5.29±0.73) %，陰性對照組的凋亡率為(5.52±0.83) %，RWDD3-shRNA組的凋亡率為(9.40±1.71) %。RWDD3-shRNA組細胞凋亡率明顯升高，與對照組相比，差異顯著(P＜0.05)，空白對照組與陰性對照組相比差異不顯著，見圖10。

Figure 9.Flow cytometry showing cell cycle distributions of the U251 cells after transfection with RWDD3-shRNA.Mean±SD.n=8.*P＜0.05 vs RWDD3-shRNA group.圖9流式細胞術檢測轉染RWDD3-shRNA后各組U251細胞周期的分布

Figure 10.The apoptotic rate of the U251 cells after transfection with RWDD3-shRNA analyzed by flow cytometry.Mean±SD.n=8.*P＜0.05 vs RWDD3-shRNA group.圖10流式細胞術檢測轉染RWDD3-shRNA后各組U251細胞凋亡的比率

討論

腦膠質瘤的預后極差，特別是腦膠質母細胞瘤，是中樞神經系統常見的高度血管化惡性腫瘤之一，患者中位生存期不超過12個月。傳統治療方法(包括手術、化療和放療)并沒有完全解決膠質瘤侵襲性生長所導致的高復發率和低治愈率難題。針對與膠質瘤發生、發展相關的基因異常的治療已成為研究熱點［4］。

腫瘤的快速生長往往伴隨腫瘤供血不足，易產生缺氧微環境，而缺氧微環境會加快腫瘤生長速度，增加腫瘤的侵襲能力。為保持腫瘤血供，腫瘤血管的生存能力將極大地提高，目前在膠質瘤中發現HIF-1α/VEGF通路在該過程中起重要作用，而VEGF的高表達需依賴HIF-1α的作用［5］。HIF-1是一種主要由分子量120 kD的HIF-1α和分子量91～94 kD的HIF-1β兩個亞基組成的異源性二聚體，其中HIF-1α是其主要的活性單位。缺氧能誘導HIF-1α的表達，并且HIF-1α能通過調節多種基因的表達，參與腫瘤生成及侵襲的作用。然而正常氧濃度下HIF-1α很快會被細胞內的氧依賴性泛素蛋白酶結合，通過作用其泛素位點Lys391和Lys477，降解HIF-1α蛋白［6］，故HIF-1α逃避泛素化的機制值得進一步探討。

小泛素相關修飾物1 (small ubiquitin-related modifier-1，SUMO-1)擁有與泛素分子相似的結構，能競爭性結合HIF-1α泛素化位點，從而阻斷蛋白質的泛素化-蛋白酶體降解途徑，增加HIF-1α的穩定性［7］。與泛素化作用相反，SUMO并不引起蛋白降解，而是通過翻譯后修飾，保護蛋白免受泛素化降解、影響細胞內的定位和蛋白與蛋白之間的相互作用［8-9］。RWDD3是一種最初在垂體腺瘤中新發現的可促進SUMO化的蛋白［3］，由195個氨基酸組成，分子量為21 kD; poly-A RNA斑點膜的實驗發現［10］，RWDD3可在多個組織中表達，但在腦組織、心臟、腎臟、肝臟、胃、胰腺、前列腺和脾臟中表達較高。RWDD3具有促進腫瘤生成、血管新生的能力［11］。研究［12］發現: RWDD3促進SUMO化的功能可穩定靶蛋白活性并促進靶蛋白表達［3］，RWDD3不僅可促進SUMO化中Ubc9和SUMO-1相互作用，并且還可以編碼RWD結構域蛋白與SUMO化的底物HIF-1α結合形成二聚體，進一步促進底物SUMO化［13］，可與HIF-1α序列中的泛素化位點Lys391和Lys477結合阻斷蛋白質的泛素化-蛋白酶體降解途徑，抑制HIF-1α的降解［6］。并且Shan等［14］在垂體瘤細胞中證實，在缺氧環境下敲低RWDD3的表達，能夠明顯抑制HIF-1α的生成，證明HIF-1α的生成需要RWDD3的調控。綜上所述，RWDD3能夠通過小泛素化穩定HIF-1α的活性，通過HIF-1α/VEGF通路，可能在腫瘤血管生成、生長、轉移等惡性進展中發揮重要作用。RWDD3對腫瘤發生發展的作用是一個新的與腫瘤調控相關的領域，值得進一步研究。

作為一種潛在的致癌基因，RWDD3對膠質瘤發生發展的影響及其詳細作用機制目前尚不明了。本課題組的前期研究［15］已發現及證實:人腦膠質瘤組織中發現RWDD3 mRNA及蛋白水平呈高表達，并與腦膠質瘤病理級別及HIF-1α/VEGF通路表達水平密切相關，并通過成功構建靶向沉默RWDD3的shRNA表達載體。本實驗為了解RWDD3對腦膠質瘤細胞U251惡性生物學能力的影響，在前期預實驗的基礎上，行MTT實驗、平板克隆實驗和BrdU實驗顯示RWDD3-shRNA組增殖和克隆形成能力較空白對照組及陰性對照組明顯降低; Transwell實驗發現RWDD3-shRNA組的細胞遷移和侵襲能力較對照組明顯減弱。流式分析表明轉染RWDD3-shRNA后，細胞周期阻滯在G0/G1期，細胞增殖受限，同時RWDD3-shRNA組細胞凋亡比例增多，綜上研究結果表明，沉默RWDD3的表達能夠有效抑制腦膠質瘤U251細胞的增殖與侵襲，RWDD3可能對腦膠質瘤的發生發展起重要作用。

本研究首次探索了RWDD3在膠質瘤細胞生長過程中的作用，在此基礎上，本項目將繼續深入探討及驗證腦膠質瘤中RWDD3與HIF-1α/VEGF通路的相關調控作用機制，以期為膠質瘤的分子靶向治療提供了一個新的候選靶點。

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(責任編輯:陳妙玲，羅森)

Effects of lentivirus-mediated RWDD3 silencing on proliferation and invasion of human glioma U251 cells

FAN Yang-hua，ZHU Xin-gen，LüShi-gang，WU Miao-jing，CHAI Yi，YE Min-hua，XIAO Bing，WU Lei
(Department of Neurosurgery，The Second Affiliated Hospital of Nanchang University，Nanchang 330006，China.E-mail: robertcarose@163.com)

［ABSTRACT］AIM: To investigate the effect of RWDD3 gene silencing on the biological characteristics of human glioma U251 cells.METHODS: A lentiviral vector expressing RWDD3 shRNA was constructed and transfeeted into the U251 cells.The expression of RWDD3 at mRNA and protein levels was detected by real-time PCR and Western blot，respectively.The cell activity was determined by MTT assay.The colony formation ability was detected by the colony formation assay.The cell proliferation ability was detected by BrdU incorporation assay.The cell invasion and migration were evaluated by Transwell assay.Flow cytometry was used to monitor the changes of cell cycle distribution and apoptosis.RESULTS: Recombinant lentivirus was successfully transfected into U251 cells.Compared with the cells transfected with the scrambled shRNA and control cells，the cell activity，colony formation ability，and the invasive and migratory activities were inhibited，the cell cycle was arrested in G0/G1phase，and the apoptosis was increased in the U251 cells transfected with RWDD3 shRNA (P＜0.05).CONCLUSION: RWDD3 plays a vital role in proliferation and invasion of glioma cells.It may serve as a potential target of gene therapy for glioma.

［KEY WORDS］Glioma; RWDD3; Lentivirus; Proliferation; Invasion

通訊作者△Tel: 0791-86311396; E-mail: robertcarose@163.com

*［基金項目］江西省自然科學基金資助項目(No.20132BAB205043) ;江西省教育廳科學技術研究項目(No.GJJ14066)

［收稿日期］2015-04-22

［文章編號］1000-4718(2015)09-1550-07

［中圖分類號］R730.23; R739.41

［文獻標志碼］A

doi:10.3969/j.issn.1000-4718.2015.09.003